周围神经缺血后GDNF表达的变化及与神经元凋亡的相关性

曾 静 王本国

(中山市中医院神经内科，广东 中山 528400)

周围神经损伤可以导致相应节段的脊髓和背根结神经元死亡，受损神经元的重要表现是神经元凋亡〔1，2〕。神经营养因子是一种可以促进神经细胞生长发育、保护神经细胞、预防神经细胞变性以及促进神经细胞再生的蛋白质。周围神经缺血可以导致缺血的神经纤维发生变性，轴突的运输速度减慢甚至停止，相关的神经元胞体发生变性〔3，4〕。但是周围神经缺血导致神经纤维发生变性是否由于神经营养因子不足还未证实。本研究观察周围神经缺血后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的变化以及神经元凋亡的情况，并分析二者关系。

1 材料与方法

1.1动物模型制备 取成年健康Wistar大鼠36只，雌雄不限，体重210～250 g。随机选择Wistar大鼠的一侧作为实验侧，另一侧为对照侧。将大鼠经腹腔麻醉后，从腹部进刀，将实验侧的髂总动脉后进行双重结扎，对照侧不做任何手术。

1.2切片制作 于大鼠术后3、5、7、14、21、28 d各取6只，经腹腔麻醉后，开胸行升主动脉插管，并用多聚甲醛固定。然后经后入路取L4～L6脊髓节段以及双侧4～6腰脊神经节，保存于固定液中，24 h后用乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片，每隔5张取1张切片，切片厚度为5 μm，每组标本收集5套切片备用。

1.3TUNEL法测细胞凋亡 参照试剂盒内说明书方法对大鼠术后3、5、7、14、21、28 d切片金星原位末端标记，计数阳性细胞，计算细胞的凋亡率(阳性细胞染色为棕黄色)。

2 结 果

2.1神经元凋亡情况 凋亡的神经元胞体体积会肿胀或者缩小，且凋亡细胞核呈深黄色或棕黄色，且位置偏移，部分神经元会变小、固缩。通过TUNEL法检测发现运动神经元的凋亡率在术后3 d时没有明显的变化，在5 d时凋亡率较对照侧显著升高，且凋亡率在术后14 d时达到高峰，随后逐渐下降，但是在观测的时间内仍然高于对照侧。而感觉神经元在术后3 d就发生明显的凋亡，在术后7 d时达到高峰，而到观测时间的28 d时降至对照侧水平，并且通过电镜观察发现凋亡的神经元在腰髓前角散在分布，且在背根节处也散在分布于周边。见表1。

表1 运动神经元和感觉神经元的凋亡率

2.2GNDF的表达情况 通过免疫组化染色检测发现，运动神经元中GDNF的表达阳性率在术后3 d明显增高，然后逐渐降低，到14 d时与对照侧相比差异无统计学意义；而感觉神经元的变化趋势则与运动神经元相同；实验侧的部分神经元胞体发生肿胀，并且细胞核偏位，神经髓鞘中施万细胞着色较对照侧增多，而神经元周围的胶质细胞仅有部分着色。表达GDNF的神经元细胞大多都是中等细胞，还有少量的大型细胞。免疫组化阳性的染色后呈棕黄色，颗粒状，大小不等。见表2。

表2 胶质细胞GDNF的表达阳性率

3 讨 论

在发育过程中，决定神经元凋亡的重要原因是神经元是否与外界靶器官建立神经调控通路〔5，6〕。有研究发现，成年大鼠的坐骨神经被切断，腰髓前角的运动神经元和感觉神经元会发生凋亡，且运动神经元死亡占41%，感觉神经元死亡占29%〔5，7，8〕。 本研究发现，切断大鼠的坐骨神经后，坐骨神经相关血管的缺血会引起相关节段神经元胞体发生结构上的变化，并且在术后的7～14 d最为明显。在显微镜下可以看到神经元胞体内线粒体肿胀，内质网扩张，甚至核膜溶解、破裂等现象〔9〕。由于这些细胞器发生了严重的病理变化，不能发挥正常水平的功能，无法为轴突再生提供充分的营养物质〔10〕。并且本研究结果说明腰髓节段的运动神经元出现损伤的时间较感觉神经元较晚，但是其持续时间较长，呈渐进性损伤。而感觉神经元细胞凋亡发生的时间较早，且严重程度也较高，说明坐骨神经缺血对感觉神经元的影响较大，此结果与临床上缺血性神经病的症状相符。神经细胞中胞体和轴突之间的联系非常密切，是一个形态和功能的整体。神经元维持正常的生理功能依赖于神经纤维的轴浆运输。如果轴突出现损伤，神经元胞体也必然受损，继而影响神经的修复和再生〔11，12〕。本研究发现运动神经元的凋亡率较感觉神经元的凋亡率较低，可能是因为其与其他神经元、组织的联系广泛，且轴突、树突较多，相互之间的关联较密切，而感觉神经元维持正常的生理功能对靶器官来源的神经营养因子依赖性较大。临床上周围神经缺血的疾病发生率较高，并且患者通常在短时间内即出现神经传导功能障碍，使得该神经支配的肢体感觉减退，运动功能障碍，大多预后与神经缺血的程度平行。而神经功能的恢复涉及多个方面，包括神经元轴突、效应器等。因此，研究在缺血损伤早期运动神经元和感觉神经元的变化对治疗缺血性神经病有重要的意义。

4 参考文献

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