五味子多糖诱导裸鼠胶质瘤细胞凋亡的作用及机制

温 娜 唐泽波 张 宇 刘兴吉 金 宏 齐 玲 于洪泉

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

神经胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，以恶性居多〔1，2〕。胶质瘤一经发现，即处于晚期，很多患者不能手术，因此化疗在胶质瘤治疗中占极为重要的地位。五味子多糖(CPSC)就是从五味子成熟干燥果实中提取出来的，具有多种药理活性的复合物。研究表明CPSC具有抗肿瘤活性〔3～6〕，但其抗肿瘤作用机制尚不清楚。本课题组前期研究发现CPSC可以抑制胶质瘤细胞的生长〔7〕。本文将进一步研究CPSC对体外培养裸鼠胶质瘤细胞凋亡的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 裸鼠胶质瘤细胞本实验室提取；CPSC(北华大学提供)；细胞培养基RPMI1640 (Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，Bax、Bcl-2抗体(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠胶质瘤细胞 复苏及培养裸鼠胶质瘤细胞，以2×106/75 cm2密度将细胞接种于培养瓶中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，每隔1～3 d换液1次。

1.3ELISA法测定裸鼠胶质瘤细胞培养上清中Bax和Bcl-2蛋白表达 将裸鼠脑肿瘤细胞以1×104/ml密度接种于24孔培养板中，实验分为对照组(不含药物)和CPSC组(200，400，800 μg/ml)，药物作用48 h，每组设5个复孔。取细胞培养上清，将上清液与包被液按1∶1比例包被后4℃过液。封闭后加入Bax和Bcl-2抗体(1∶500稀释)于4℃过夜。加入二抗室温下孵育2 h，加显色液室温避光显色。于自动酶标仪492 nm处测定A值，并计算Bax和Bcl-2比值。

1.4细胞免疫组织化学法检测Bax和Bcl-2蛋白在裸鼠胶质瘤细胞阳性表达率 按上述方法和分组用不同剂量CPSC作用细胞48 h后，吸出培养上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，灭活后一抗过夜，二抗室温孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察，以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性着色，按照公式计算Bax和Bcl-2表达阳性率(阳性细胞数/总细胞数×100%)。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结 果

2.1CPSC对体外培养裸鼠胶质瘤细胞上清中Bax和Bcl-2蛋白表达水平 不同浓度CPSC作用裸鼠胶质瘤细胞48 h后，与对照组(0 μg/ml)比较，其培养上清中Bcl-2蛋白表达水平均下降(P<0.01)；Bax的表达值随CPSC浓度的增加而递增。多糖组Bax/Bcl-2均升高，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组裸鼠胶质瘤细胞培养上清中Bax和Bcl-2蛋白表达

2.2细胞免疫组织化学法检测各组裸鼠胶质瘤细胞Bax和Bcl-2阳性表达率 CPSC作用裸鼠胶质瘤细胞48 h后，400和800 μg/ml多糖组Bax蛋白阳性表达率均明显升高，与对照组(0 μg/ml)比较有统计学意义(P<0.01)，400和800 μg/ml多糖组Bcl-2蛋白阳性表达率均下降，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组裸鼠胶质瘤细胞Bax和Bcl-2阳性表达率(%)

3 讨 论

脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，发病率和死亡率都很高，病程难以控制，目前治疗方案仍然是手术切除辅以放疗和化疗等综合治疗为主。诱导或促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的基本方法之一。五味子抗肿瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位〔4〕。其中，CPSC是其抗肿瘤的主要成分之一，其药理研究表明，具有抑瘤〔4～6〕等作用。因此，CPSC具有预防和治疗肿瘤的潜在价值。

细胞凋亡是广泛存在于生理和病理状态下的有序的受一系列基因严格控制的程序化死亡，是级联式基因表达的结果，可以通过多种形式诱导凋亡发生。目前已发现许多与凋亡相关的基因，其中Bcl-2家族对凋亡起重要调节作用〔8〕，Bax和Bcl-2是其家族的两个重要成员代表，其作用相互拮抗，Bax则促进细胞凋亡，Bcl-2抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax之间的比例是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，研究表明〔9〕，当Bcl-2蛋白表达增加时，在细胞内可形成Bcl-2/Bax异源二聚体，抑制凋亡的产生。当Bax表达加强时则形成同源二聚体Bax/Bax将加速细胞凋亡，因此，Bax和Bcl-2表达的比例对细胞的凋亡与否起决定性作用〔10〕。

本研究结果显示CPSC可能通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白激活线粒体信号传导路径，引起细胞凋亡，从而使裸鼠胶质瘤细胞发生凋亡。但其机制还需进一步深入研究。

4 参考文献

1徐俊杰，于洪泉，赵 伟，等.西兰花多肽对C6胶质瘤细胞的诱导凋亡作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2013;39(1)：8-11.

2Jiang T，Tang GF，Lin Y，etal.Prevalence estimates for primary brain tumors in china：a multi-center cross-sectional study〔J〕.Chin Med J，2011;124(17)：2578-83.

3于 赫，李 冀，齐 彦.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其免疫学机理初探〔J〕.中医药信息，2010;27(2)：26-7.

4许珂玉，肖建英.五味子多糖对甲状腺癌细胞株SW579凋亡及survivin表达的影响〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011;37(2)：279-83.

5Chiu PY，Lam PY，Yan CW，etal.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts〔J〕.Fitoterapia，2011;82(4)：682-91.

6甘 露.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长及免疫功能的调节作用〔J〕.免疫学杂志，2013;29(10)：867-70.

7温 娜，唐泽波，袁 瑞，等.五味子粗多糖对脑胶质瘤细胞生长的作用〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(12)：2837-8.

8Hardwick JM，Chen YB，Jonas EA.Multipolar functions of Bcl-2 proteins link energetics to apoptosis〔J〕.Trends Cell Biol，2012;22(6)：318-28.

9刘 英，郭世杰，孙景辉.缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌细胞凋亡及凋亡蛋白Bax，Bcl-2表达的变化〔J〕.临床儿科杂志，2009;27(12)：1172-6.

10Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins：mechanisms，physiological roles，and therapeutic opportunities〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(8)：1378-86.