高效脱硫异养反硝化菌株的代谢特性研究

于虹霞，任南琪，陈 川

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，哈尔滨 150090)

伴随国家对于水污染治理的日益重视，相关水质排放标准也日益严格，如何在已有工艺基础上进行改进，提高废水中污染物的处理效率成为重要课题.自养-异养微生物协同共代谢的反硝化脱硫技术(DSR)是通过自养硫氧化反硝化菌和异养反硝化菌的协同作用，实现了碳氮硫的同步去除，并提高了单质硫的转化率的一种工艺[1].目前的研究工作表明，DSR 工艺系统内的自养微生物可以反硝化的同时氧化硫化物，异养反硝化微生物主要作用是脱氮.很少有文献报道异养反硝化菌可以同时进行硫化物的氧化和反硝化作用，而且已有报道中微生物的硫化物转化效率很低，无法进行用于工程实践.

陈川[2]等人在研究反硝化脱硫技术过程中发现了一类异养反硝化菌既可进行硫化物的氧化也可进行反硝化的细菌，命名为C27.它的脱硫能力很强，极可能用于工程实践.

1 材料与方法

本实验的菌株Pseudomonas sp. C27是实验室之前富集并分离的.菌种来源是EGSB 反应器中的颗粒污泥，由于在EGSB中连续运行半年以上，其中具有反硝化脱硫功能的菌种已成功完成定向富集.实验开始前，先将实验室密封保存的菌株C27从4 ℃冰箱内，进行扩培，液体培养基按照表1进行配比[3].

表1 液体培养基的营养成分配比

注：试剂为分析纯

固体培养基成分配比不变，只是在液体培养基中加入2%的琼脂.每组试验做两个平行样，试验以无菌蒸馏水作为空白参照.由于硫化物的挥发性强，药品Na2S·9H2O在空气中易变质，因此要在用磷酸盐缓冲液将pH调到8左右后最后加入.空气浴振荡器设定在130 r/min，培养温度设定在30 ℃.基于微生物生长需要，每1 L 液体培养基加入1 mL 微量元素，微量元素配比见表2.

表2 培养基中微量元素配比

注：试剂均为分析纯(AR)

实验操作过程中，使用容量为250 mL的血清瓶，每个装入200 mL液体培养基后，要先用氮气吹脱3 min后，再用橡胶塞将血清瓶密封，用灭菌锅灭菌待用.为避免菌液干扰，菌体被转入培养基前要在8 000 r/min下先离心10 min，再用无菌蒸馏水润洗3遍.

2 C27不同条件下的代谢情况

2.1 自养条件下微生物代谢情况

在空白对照实验中，未接种菌体的无菌蒸馏水在同样条件下，硫化物、硝酸盐和乙酸盐等几个主要指标降解率均小于3%，说明非生物对于碳氮硫的自然降解情况可忽略不计.图1表示的是C27在自养状态下，硫化物的降解情况，图2为自养状态下硝酸盐降解情况.

图1 自养状态下硫化物降解情况

图2 自养状态下硝酸盐降解情况

自养条件下，两个系统按培养基比例添加了硝酸盐和无机碳酸氢钠，未加有机碳源，初始硫化物质量浓度分别为50 mg/L和100 mg/L，初始硝酸盐质量浓度100 mg/L.由图1、2可见，反应初期(前5 h)，两个系统中的硫化物和硝酸盐只有微小下降，反应后期(5～20 h)，两个系统中的硫化物和硝酸盐质量浓度几乎不再变化.总体来看，自养状态下，C27几乎不能降解硫化物，也不能利用硝酸盐，而且硫化物和硝酸盐的降解情况与初始硫化物质量浓度没有直接关系.肉眼实际观察，两个系统中的菌液质量浓度明显降低，说明自养系统中缺少有机碳源，C27很难存活，很难起到脱硫作用.

2.2 异养条件下微生物代谢情况

这组实验加入乙酸盐作为有机碳源，硝酸盐作为氮源，初始质量浓度分别是270 mg/L和 430 mg/L，不添加硫化物作为硫源，以考察在异养加氮不加硫条件下，菌株是否仍然具有反硝化能力.结果如图3所示.在反应前段，由乙酸盐和硝酸盐率先降解，速率都很快，在20 h左右乙酸盐降解了超过2/3，硝酸盐仅剩77.3 mg/L，亚硝酸盐质量浓度一直在增加，直到20 h左右达到峰值质量浓度47.5 mg/L.20 h之后所有底物降解速度都放缓，反应后期，硝酸盐全部被降解，亚硝酸盐质量浓度缓慢降低，直至最终降为0，乙酸盐仅剩余18.7 mg/L.这是因为硝酸盐降解后会产生一定量的亚硝酸盐，反应过程中有少量气体生成，由以前的实验研究结果推测产物是而亚硝酸盐最终降解生成的氮气.

图3 异养加氮不加硫条件下，底物降解曲线

2.3 不同硫氮比对微生物代谢影响

陈川[3]等人已经完成的考察不同C/N 比的实验中，证实了C27 对于硫化物的降解能力与有机碳源质量浓度并无关联，并不受C/N 比的影响，这与DSR-EGSB 一体式反应器中，硫化物降解能力受不同的C/N 比影响的结论截然不同.那么哪些条件能真正决定末端氧化产物是什么？鉴于C27 这类功能菌和实际工艺处理效果影响因素的差异，我们推测影响硫化物的降解速率的原因之一可能是硫氮比.

因此，本节内容重点考察在微氧环境条件下，在不同硫氮比C27对碳氮硫污染物的降解效能的影响，还是以硫化物、硝酸盐、乙酸盐三个指标降解效率变化来表达.设定硫氮比四个梯度分别是2.5、1.0、0.625、0.5.每组装瓶成分和培养基相同，主要为硫化物，硝酸盐和乙酸盐.之后将C/N固定为1.26，这是因为根据前期试验结果，DSR反应器在此碳氮比情况下，保证碳源充足，可达到最大负荷，运行效果最好.硫化物的底物质量浓度固定在100 mg/L，每批改变S/N比，硝酸盐和乙酸盐根据不同比例变化添加.由于是微氧环境，溶解氧质量浓度要控制在0.2～0.4 mg/L之间.

2.3.1 硫氮比为5∶2时的代谢情况

硫氮比是5∶2时，初始质量浓度硫化物为100 mg/L，硝酸盐17.5 mg/L.由图4所示，在反应前段，乙酸盐和硝酸盐都能很快降解，15 h左右即降到0，亚硝酸盐在10 h左右达到峰值，20 h降解完全.而硫化物在前段降解很快，但在15～20 h左右达到瓶颈，之后一直在80 mg/L上下浮动.这说明，当硫氮比是5∶2时，乙酸盐和硝酸盐降解效果很好，亚硝酸盐也没有积累，很快就降解了，但是由于硫氮比很高，硫化物过量，反应后期缺少碳源和氮源，C27无法进一步降解硫化物.

图4 S/N=5∶2时，底物降解曲线

2.3.2 硫氮比为5∶5时的代谢情况

硫氮比是5∶5时，初始质量浓度硫化物为100 mg/L，硝酸盐43.75 mg/L.由图5所示，在反应前半段，乙酸盐和硝酸盐都能很快降解.乙酸盐前10 h稍慢，15～25 h迅速降解直到11.5 mg/L；硝酸盐一直稳定降解，在20 h左右降到0；亚硝酸盐在15 h左右达到峰值23.4 mg/L，在25 h降解完全.而硫化物在前段0～10 h降解很快，但之后一直稳定在38 mg /L左右.这说明，在硫氮比是1的条件下，乙酸盐降解效率在90%以上，硝酸盐几乎全部降解，亚硝酸盐也没有积累，硫化物少量过量，可能是反应后期缺少足够氮源，硫化物没能进一步被降解.

图5 S/N=5∶5时，底物降解曲线

2.3.3 硫氮比为5∶8时的代谢情况

硫氮比是5∶8时，初始质量浓度硫化物为100 mg/L，硝酸盐增加到70 mg/L.图6表明，在反应前半段0～20 h，硫化物、乙酸盐和硝酸盐都能顺利降解.乙酸盐质量浓度稳定在19.4 mg/L左右，有机碳去除率接近90%；硝酸盐10 h左右几乎被降解；亚硝酸盐在10 h左右达到峰值，在20 h降解完全；而硫化物在前半段也几乎全部降解.数据说明，5∶8的硫氮比条件下，硫化物、乙酸盐和硝酸盐去除效果都很好，硫化物、硝酸盐降解率接近100%.

图6 S/N=5∶8时，底物降解曲线

2.3.4 硫氮比为5∶10时的代谢情况

硫氮比是5∶10时，初始质量浓度硫化物为100 mg/L，硝酸盐87.5 mg/L，数据结果如图7所示.此条件下，硫化物、乙酸盐和硝酸盐仍然都能顺利降解.经过0～10 h的中速降解和10～20 h的快速降解，乙酸盐最后降解速率达到了88.7%；硝酸盐前10 h降解速度非常快，10～15 h缓慢降解到0；亚硝酸盐在10 h左右达到峰值，在20 h降解完全；而硫化物在前20 h也几乎全部降解.5∶10硫氮比条件条件下，硫化物、乙酸盐和硝酸盐的降解效率都很高，硫化物、硝酸盐降解率也接近100%.

图7 S/N=5∶10时，底物降解曲线

经过硫氮比四个不同梯度下，硫化物，硝酸盐和乙酸盐降解效果的横向比较，可以看出，硫氮比对C27的代谢有比较明显的影响.高硫氮比条件下，会刺激C27对碳氮硫的代谢能力，而且C27降解硫化物的能力与系统中硝酸盐质量浓度有关，与乙酸盐质量浓度无明显关系.实验结果表明，C27降解污染物效果最佳的硫氮比为5∶8.

3 结 论

本文以高效脱硫异养反硝化菌种C27为对象，研究其在不同营养环境下的代谢规律，分别考察了C27在自养、异养还有不同硫氮比条件下，对硫化物、硝酸盐和有机碳三种污染物的降解速率变化.得到的结论如下：

1)在仅投加硝酸盐和无机碳酸氢钠，而没有有机碳源的自养状态下， C27很难存活，肉眼可以看到菌液质量浓度逐渐降低.自养条件下的C27几乎不能降解硫化物，也不能利用硝酸盐，而且硫化物和硝酸盐的降解情况与初始硫化物质量浓度没有直接关系.

2)以乙酸盐为有机碳源的异养条件下，加氮源不加硫源时，菌株仍然具有反硝化能力，乙酸盐降解80%以上，硝酸盐全部被降解，但是此时相对于正常提供硫源的异养条件，乙酸盐、硝酸盐的降解时间变长.

3)维持C/N=1.26，在硫氮比5∶2、5∶5、5∶8、5∶10四个不同梯度下，C27降解效果的横向比较，证明硫氮比对C27的代谢有比较明显的影响.高硫氮比条件下，C27对碳氮硫的代谢能力都会提高，而且C27降解硫化物的能力与系统中硝酸盐质量浓度有关，与乙酸盐质量浓度无明显关系.实验结果表明，C27降解污染物效果最佳的硫氮比为5∶8.

参考文献：

[1] CHEN C, REN N Q, WANG A J,etal. Simultaneous biological removal of sulfur, nitrogen and carbon using EGSB reactor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78(6): 1057-1063.

[2] CHEN C, REN N Q, WANG A J,etal. Microbial community of granules in expanded granular sludge bed reactor for simulaneous biological removal of sulfate, nitrate and lactate[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 79(6): 1071-1077.

[3] 陈 川. 自养菌-异养菌协同反硝化脱硫工艺的运行与调控策略[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2011.