浙贝乙素与浙贝乙素胆酸酯对人细胞色素P450酶活性的影响

吴潇，彭瑛，张鹏，吴继洲

[1.天津市中药质量控制(企业)重点实验室，天津中新药业研究中心，天津 300457;2.中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京 210009;3.湖北省天然药物与资源评价重点实验室，华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030]

湖北贝母为百合科贝母属植物湖北贝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)的干燥鳞茎，被《中华人民共和国药典》2010年版收载，具有镇咳、平喘、祛痰的功效[1]。系统研究表明，总生物碱为其活性部位[2-3]。其中主要单体成分浙贝乙素具有良好的镇咳、祛痰活性[4-5]，具有进一步开发的潜能。蛇胆川贝散为一经典中药复方，临床疗效显著，毒副作用小。现代药理学研究表明，生物碱和胆汁酸为其主要有效成分。本课题组借助结构拼合的思路，合成了浙贝乙素与胆汁酸的系列酯化合物，经药效学筛选，浙贝乙素胆酸酯的镇咳、祛痰活性最强，且毒性远低于浙贝乙素[5-6]。

代谢性药物相互作用占药动学相互作用的40%，从1995年到现在，由代谢性药物相互作用引起药理或毒理效应变化的临床案例报道增加了10倍以上[7]。因此，在活性化合物开发的早期进行代谢性相互作用的研究具有重要意义。笔者在本研究中采用体外混合探针底物法，对浙贝乙素和浙贝乙素胆酸酯对5种主要的人细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶亚型的抑制作用进行评价，以期为浙贝乙素及其衍生物的进一步开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试药 浙贝乙素(纯度＞98%)、浙贝乙素胆酸酯(纯度＞98%)由华中科技大学同济医学院药学院吴继洲教授提供;奥美拉唑钠盐(批号:100367-201104)、氢溴酸右美沙芬(批号:100201-199901)、马来酸咪达唑仑(批号:171250-200401)、左氧氟沙星(批号:130455-201117，纯度:98%)购自中国食品药品检定研究院;甲苯磺丁脲(批号:017K1025)、睾酮(批号:564026)购自Fluka公司;非那西丁(批号:016K1602)、对乙酰氨基酚(批 号:099K0126V)、4-羟 基 甲 苯 磺 丁 脲 (批 号:0001407794)、5-羟基奥美拉唑(批号:1194-013A3)、右啡烷(批号:BCBF7621V)、1-羟基咪达唑仑(批号:065K3262)、6β-羟基睾酮(批号:306461)购自 Sigma 公司;十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氢钠(NaH2PO4· 2H2O)、氯化钾(KCl)、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)购自南京化学试剂厂;甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司;其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器 美国热电公司Finnigan高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含Finnigan Surveyor高效液相色谱系统、Finnigan TSQ Quantum Discovery max质谱系统、电喷雾离子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan数据处理软件);色谱柱 Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm);Vortex-Genie 2 涡旋混合器;Eppendorf高速冷冻离心机;Milli-Q Gradient A1超纯水机。

1.3 人肝微粒体 混合人肝微粒体(human liver microsomes，HLMS)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，由 10名捐献者的肝脏制得，其 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 活性由瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司鉴定，微粒体蛋白浓度为10 mg ·(500 μL)－1。

1.4 肝微粒体体外孵育 温孵反应体系包括人肝微粒体(0.2 mg·mL－1)，氯化镁(MgCl2，10 mmol·L－1)，磷酸盐 缓 冲 液 (Na2HPO40.1mol· L－1，NaH2PO40.1 mol·L－1，KCl 0.1 mol·L－1，pH=7.4)，混合探针底物(CYP1A2/非那西丁/70 μmol·L－1，CYP2C9/甲苯磺丁脲/4 2.7 μmol·L－1，CYP2C19/奥美拉唑/22.6 μmol·L－1，CYP2D6/右美沙芬/4.05 μmol·L－1，CYP3A4/咪达唑仑/3.53 μmol·L－1，CYP3A4/睾酮/53.3 μmol·L－1)，以及受试化合物，反应体系中有机溶剂的含量≤1%。将反应体系在37℃恒温水浴中预热5 min后，加入NADPH能量系统(其组成为:NADP/0.5 mmol·L－1，G-6-P/10 mmol·L－1，G-6-P-DH/1 U·mL－1)启动反应，温孵20 min后，0℃冰浴快速终止反应。

实验分为空白对照组、浙贝乙素组和浙贝乙素胆酸酯组，空白对照组以溶剂甲醇代替试药，浙贝乙素和浙贝乙素胆酸酯在温孵反应体系中的系列终浓度均为0.4，2，8，40，200 μmol·L－1。各温孵反应平行做3 份。

1.5 样品处理与色谱分析 在温孵体系中加入含内标(左氧氟沙星，200 ng·mL－1)的甲醇溶液(1∶1)沉淀蛋白，振荡3 min，20 000 r·min－1离心10 min 后，取上清液进样，分析其中6种探针底物特征代谢物的浓度。色谱条件:Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm)，流 动 相 为:(A)含 1‰ 甲 酸 的0.5 mmol·L－1醋酸铵缓冲液，(B)甲醇，梯度洗脱，0 ～2.0 min，5% ～50%B;2.0 ～6.0 min，50% ～60%B;6.0 ～7.0 min，60%B;7.0 ～7.5 min，60% ～5%B;7.5 ～ 12.0 min，5%B，流速为 200 μL·min－1，柱温40℃。质谱条件:ESI离子源:电喷雾电压 4 400 V(+)，加热毛细管温度 350℃，鞘气(N2)流速7.5 L·min－1(30 Arb)，辅助气(N2)流速10 L·min－1(10 Arb)，碰撞气(Ar)压力0.2 Pa(1.5 mTorr)。正离子模式下同时扫描各代谢产物和内标的母离子及产物离子，选择丰度最大的碎片离子进行多级反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，各化合物的 MRM参数见表1。

1.6 IC50值的计算 受试化合物任一浓度水平下所测任一亚型代谢产物的生成量与相应溶剂空白对照组中该代谢产物的生成量之比即为该化合物水平下所测亚酶活性的相对剩余活力百分数，以其为纵坐标(Y)，受试化合物的对数(Log10)摩尔浓度为横坐标(X)，借助软件GraphPad Prism 4.0 demo拟合即可得到受试化合物对任一CYP亚型的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)抑制效应图。

表1 各化合物母离子和碎片离子MRM参数Tab.1 MRM parameter of parent ion and fragment ion of each compound

2 结果

2.1 各代谢产物的标准曲线 在灭活的人肝微粒体温孵体系中，加入系列浓度的混合探针代谢产物(0.066/0.014/0.0055/0.0058/0.0058/0.049，0.013/0.035/0.014/0.012/0.015/0.098，0.33/0.070/0.028/0.023/0.029/0.16，0.66/0.17/0.055/0.039/0.058/0.33，1.32/0.35/0.14/0.078/0.15/0.82，3.29/0.7/0.28/0.19/0.29/1.64，6.58/1.74/0.55/0.39/0.73/3.28，13.16/3.48/1.38/0.78/1.46/8.20，25.00/6.97/2.76/1.94/2.63/16.39 μmol·L－1，对乙酰氨基酚/4-羟基甲苯磺丁脲/5-羟基奥美拉唑/右啡烷/1-羟基咪达唑仑/6β-羟基睾酮)，按照“样品处理与色谱分析”项处理分析。各特异性探针底物的线性回归方程和线性范围分别为:对乙酰氨基酚/CYP1A2:Y=0.136 1X － 0.003(R2=0.995 7，0.066 ～25.00 μmol·L－1);4-羟基甲苯磺丁脲/CYP2C9:Y=0.248 6X+0.001 5(R2=1.000 0，0.014 ～6.97 μmol·L－1);5-羟 基 奥 美 拉 唑/CYP2C19:Y=0.639 3X+0.002 3(R2=0.999 8，0.005 5 ～2.76 μmol·L－1);右啡烷/CYP2D6:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.066 ～ 16.39 μmol·L－1);1-羟基咪达唑仑/CYP3A4:Y=2.466 3X －0.007 9(R2=0.999 0，0.005 8 ～ 2.63 μmol·L－1);6β-羟基睾酮/CYP3A4:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.049～16.39 μmol·L－1)。

2.2 浙贝乙素、浙贝乙素胆酸酯对人肝微粒体CYP酶活性的影响 浙贝乙素、浙贝乙素胆酸酯对人肝微粒体5种主要CYP酶亚型活性的影响分别见图1，图2。结果表明，浙贝乙素在 0 ～200 μmol·L－1范围内对CYP2C9亚型基本没有抑制效应，对 CYP1A2，CYP2D6，CYP2C19，CYP3A4四种亚型有很弱的抑制效应，抑制率≤50%。浙贝乙素胆酸酯在0～200 μmol·L－1范围内对 CYP1A2 亚型有较强的抑制作用，IC50约为 128 μmol·L－1;对 CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4四种亚型有很强的抑制作用，IC50分别约为 4(CYP2C9)，8(CYP2C19)，5(CYP2D6)，3(CYP3A4，睾酮为底物)，11 μmol·L－1(CYP3A4，咪达唑仑为底物)。

图1 浙贝乙素对5种人肝微粒体CYP酶亚型的抑制曲线Fig.1 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

3 讨论

在药物开发的早期阶段，使用体外混合探针底物法进行人肝微粒体孵育实验，可以经济、省时、高通量地获得候选化合物对体外肝微粒体CYP酶活性的影响，以期在综合考虑药理活性和对代谢酶影响等基础上筛选出药理活性高而又不易引起代谢性相互作用的候选药物。理想的用于检测CYP同工酶的探针底物应该对特定的CYP酶亚型具有优良的选择性、敏感性以及可获得性，本实验选择的探针底物均为美国药品研究和制造商协会(PhRMA)推荐使用的体外探针底物[8]。CYP3A4的配体结合位点具有显著的催化区域专一性，并对改变底物特异性、蛋白结构及协同性具有不同的作用[9]，因此在进行体外考察药物对CYP3A4活性的影响时，建议至少选择两种结构不相关的探针底物，因此本实验中选择睾酮和咪达唑仑两种底物来考察浙贝乙素及其胆酸酯对CYP3A4的抑制作用。

图2 浙贝乙素胆酸酯对5种人肝微粒体CYP酶亚型的抑制曲线Fig.2 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

笔者采用本实验室前期建立的成熟的体外混合探针底物法，对具有良好镇咳、祛痰活性的浙贝乙素及其衍生物浙贝乙素胆酸酯进行了对人肝微粒体CYP酶活性影响的考察，结果表明浙贝乙素对考察的5种CYP酶亚型基本没有或仅有很弱的抑制作用，而其衍生物浙贝乙素胆酸酯对考察的5种CYP酶亚型具有较强的抑制作用，表明浙贝乙素胆酸酯在药物代谢性相互作用方面的安全性不如其母体(浙贝乙素)。浙贝乙素胆酸酯对 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制作用类型，尚需进一步的酶促动力学研究才能说明。

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