黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗感嘧霉胺菌株胞外酶活性比较研究

赵晓军, 任璐,殷辉,周建波

(1.山西省农业科学院 植物保护研究所，山西 太原 030016；2.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西 太原 030006；3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗感嘧霉胺菌株胞外酶活性比较研究

赵晓军1,2, 任璐2,3,殷辉1,2,周建波1,2

(1.山西省农业科学院 植物保护研究所，山西 太原 030016；2.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西 太原 030006；3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

比较了黄瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)抗感嘧霉胺菌株的胞外酶活性差异。以敏感菌株DT9、中抗菌株SZ5和高抗菌株SZ15为材料，在嘧霉胺药剂处理下测定了胞外酶羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的活性。结果表明，药剂处理后敏感菌株的胞外酶活性均升高，抗性菌株的胞外酶活性均降低。由此可见，黄瓜灰霉病菌对嘧霉胺产生抗性后，抗性菌株胞外酶活性发生了变化。

灰霉病菌；嘧霉胺；抗药性；羧甲基纤维素酶；β-葡萄糖苷酶；果胶酶

黄瓜是蔬菜产业的重要组成部分，山西省黄瓜种植面积2012年达33 333公顷次。目前，黄瓜灰霉病在山西省黄瓜种植区普遍发生，并随着保护地种植模式的推广，近年来发生日趋严重[1,2]，直接影响着蔬菜产业的可持续发展。

灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染所致，该病菌具有寄主范围广、遗传变异大、繁殖速度快和适合度高等特点，长期使用单一药剂易产生抗药性[3,4]。然而，化学防治依然是生产上控制灰霉病的主要措施。目前，用于防治灰霉病的杀菌剂主要包括：苯并咪唑类、氨基嘧啶类、苯氟磺胺类、二甲酰亚胺类、N-苯氨基甲酸酯类等。据报道灰霉病菌已对多类杀菌剂产生了抗性，这是病原菌长期在单一药剂选择作用下，通过遗传、变异获得的适应性。特别是随着高效、内吸、选择性强的杀菌剂被开发和广泛应用，对杀菌剂的抗性越来越严重和普遍，成为制约化学防治措施发展的关键因素之一[5]。

嘧霉胺是防治灰霉病的高效杀菌剂，已有多年用药史。在我国辽宁和江苏等地已经报道了灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性菌株，在山西一些菜区也产生了抗药性[6]。有研究表明，该药剂能够抑制病菌蛋氨酸的合成和胞壁水解酶的分泌[7]。为了进一步探索灰霉病菌对嘧霉胺抗药性的生化机理，了解抗感菌株的种群适合度，寻找新的、有效的抗药性检测方法与综合治理措施，进而指导杀菌剂的科学使用，本研究比较了黄瓜灰霉病菌抗感嘧霉胺菌株在药剂处理下胞外酶的活性。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

所试病原菌均为采自山西省各地区的黄瓜灰霉病菌菌株，室内已分离纯化并检测其对嘧霉胺的敏感性。选取敏感菌株DT9，中抗菌株SZ5及高抗菌株SZ15进行酶活性测定。

1.2 酶液提取

收集不同含药浓度下液体培养基的菌丝，用灭菌去离子水冲洗5次，真空抽滤后每份样品取菌丝3 g。将菌丝置于预冷的研钵里，加入少量的液氮、石英砂及酶提取液。冰浴条件下磨成匀浆，匀浆后转入10 mL离心管，最后在4 ℃条件下10 000 rpm离心15 min，取上清液做酶液，置冰浴中待用。

1.3 酶活力测定

标准曲线的制备及胞外酶活性的测定采用袁胜东[8]等的方法。

1.4 数据分析

原始数据的整理采用Excel软件完成，差异显著性测验采用SPSS软件完成。

2 结果与分析

胞外酶活性测定

嘧霉胺不处理条件下，如表1所示，敏感菌株DT9(CK)的羧甲基纤维素酶(CMC)、β-葡萄糖苷酶(BG)、果胶酶(PG)3种酶活性与高抗菌株SZ15相比相对较高，分别达到414.34 U·g-1、392.48 U·g-1、0.73 U·g-1。中抗菌株SZ5(CK)的羧甲基纤维素酶(CMC)、β-葡萄糖苷酶(BG)、果胶酶(PG)3种酶活性与高抗菌株SZ15相比相对较高，分别达到424.45 U·g-1、400.47 U·g-1、0.73 U·g-1。

表1 嘧霉胺对其抗感菌株胞外酶活性的影响/U·g-1

注：同一行数据后标明不同小写字母表示0.05水平差异显著，SPSS12.0邓肯氏新复级差法。

Note：The same line followed by the different small letters show the significant difference at 5% level, SPSS12.0 Duncan,s new multiple range test.

嘧霉胺处理后，如表1所示，敏感菌株DT9的羧甲基纤维素酶(CMC)和β-葡萄糖苷酶(BG)活性较对照增大，分别达到531.45 U·g-1和461.80 U·g-1。中抗菌株SZ5的CMC活性与对照相比没有明显差异，高抗菌株SZ15的CMC活性较对照有所降低，仅为59.53 U·g-1。药剂处理后，SZ5和SZ15的BG活性均较对照有所降低，SZ15的BG活性仅为59.53 U·g-1。DT9与SZ15的CMC和BG活性在5%水平均存在显著差异。

DT9和SZ5的果胶酶(PG)活性较对照没有显著差异， SZ15的PG活性较对照显著降低，药剂处理后SZ15的PG活力仅为0.08 U·g-1。

3 讨论

植物细胞壁对保持细胞的形态和保护细胞的完整性有着重要的作用，而植物病原菌在侵入和定殖的过程中可以分泌多种胞外细胞壁降解酶，使得病原菌反复接触并穿透寄主细胞壁。病原菌细胞壁降解酶与寄主细胞壁的相互作用直接影响到寄主和病原菌关系的平衡[9]。这种相互作用直接影响病原菌的致病过程。

本研究测定了嘧霉胺抗感菌株羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶3种细胞壁相关酶的活性，研究结果显示，嘧霉胺处理后，敏感菌株羧甲基纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶活性均升高，果胶酶没有明显变化，中抗菌株的β-葡萄糖苷酶活性降低，其余两种酶没有显著变化，而高抗菌株3种酶的活性均降低。由此可见，与敏感菌株相比，灰霉病菌抗性菌株虽然在药剂存在下可以存活，但菌株的致病力显著降低。有研究表明，不同抗感菌株产生的纤维素活力有明显不同，强致病力的菌株产生的酶活性较高，而侵染速率慢的菌株产生的纤维素酶活力低[10]，这反应了菌株致病力强弱与酶活性呈正相关，对抗感菌株致病力强弱的鉴定有重要意义。

结合抗感菌株胞外酶活性和其接种后的病斑面积(数据另文待发)进行分析，发现菌株羧甲基纤维素酶活性和β-葡萄糖苷酶与病斑面积相关性不明显，而果胶酶与病斑面积紧密相关，推测果胶酶在病原菌的致病过程中起着较为重要的作用。这一结果与周叶方等[11]报道的一些植物病原细菌的致病关键酶是果胶酶的结果相一致。这一结果也在一定程度上反映了灰霉病菌的致病机制。

另外，近年来相关报道显示，灰霉病菌在菌丝生长速率、病原菌致病性及抗药性的表现型等方面具有极其丰富的多样性[12～14]。结合上述研究结果，推测灰霉病菌的三种酶活性变化规律可能是灰霉病菌在酶表现型的多样性体现。

黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)对嘧霉胺敏感性菌株3种胞外酶(羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶)的活性相对较高，表明黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)对嘧霉胺敏感性菌株种群适合度较高。综上所述，无药剂选择压时，嘧霉胺抗性菌株的致病力弱于敏感菌株，敏感菌株相对容易侵染寄。这一研究结果需今后进一步探索相关证据加以证明。且本研究仅探讨了3株抗感菌株，今后还需大量菌株进行测定，为嘧霉胺抗药性机理的研究奠定基础。

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ComparisonofEctoenzymeActivitiesBetweenSensitiveandResistantIsolatesofBotrytiscinereatoPyrimethanil

Zhao Xiaojun1,2,Ren Lu2,3,Yin Hui1,2,Zhou Jianbo1,2

(1.InstituteofPlantProtection,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,TaiyuanShanxi030016,China; 2.ShanxiKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,TaiyuanShanxi030006,China; 3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

To explore the resistance mechanism ofBotrytiscinereato pyrimethanil, this study compared ectoenzyme activities between sensitive and resistant isolates.The activities of CMC, BG and pectinase of sensitive strain DT9, resistant strains SZ5 and SZ15 were tested with or without the treatment of the fungicide. The results showed that activity of CMC, BG and pectinase of sensitive strain were increased, but resistant strains were reduced when treated with the fungicide. Thus ectoenzyme activities of the resistant isolates were significantly different from the sensitive strain.

Botrytiscinerea; Pyrimethanil；Resistance; Carboxymethyl cellulase；β-glucosidase; Pectinase

2014-09-11

2014-10-14

赵晓军(1974-)，男(汉)，山西临汾人，副研究员，博士，研究方向：杀菌剂生测及抗药性研究。

山西省基金项目(2010021033)；山西省农科院育种工程项目(11yzgc144；YZJC1309)

S481+.4

A

1671-8151(2014)06-0508-03

(编辑：武英耀)