海洋假单胞菌PT－8胞外硒多糖的制备

李 江，叶 淑 红，王 际 辉，王 晗，肖 珊

(大连工业大学 辽宁省食品生物技术重点实验室，辽宁 大连 116034)

0 引 言

海洋假单胞菌属于海洋细菌，由于其特殊的生存环境，使其产生的胞外多糖结构新颖，功能独特，活性丰富，是开发多糖类海洋功能食品的重要资源[1]。硒是生命必需的微量元素，它可以直接或间接地清除体内氧自由基，并且能够抑制肿瘤、心血管等疾病的发生[2]。但由于无机硒毒性强，应用受到限制。因此急需寻找一种生物活性高且毒性低的有机硒化合物。据报道，多糖硒的配合物作为补硒剂不仅具有稳定性和溶解性能，而且释放出硒后配体多糖不会对身体产生任何毒副作用[3]。刘振锋等[4]研究硒多糖具有抗肿瘤、抗氧化、提升机体免疫力、拮抗重金属蓄积、抗病毒等多种药理活性。国外对硒多糖的研究很少。本实验以海洋细菌假单胞菌PT－8发酵产胞外硒多糖，并对该硒多糖的流变性进行了研究。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌 种

假单胞菌PT－8，由作者所在实验室自深海海泥中分离、鉴定并保藏。

1.1.2 培养基

基础培养基(g／L)：葡萄糖5，牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂1.5%～2%。

种子培养基(g／L)：葡萄糖5，蛋白胨10，氯化钠5，牛肉膏3。

发酵培养基(g／L)：蔗糖35，牛肉膏20，氯化钠55，K2HPO41，MgSO41，KH2PO40.5，MnSO40.5，pH 7.5。

1.1.3 试剂与仪器

主要试剂：苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇等，均为分析纯。

主要仪器：真空冷冻干燥机、高速冷冻离心机、SNB－1数字式黏度计、紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 富硒实验

1.2.1.1 加硒浓度的确定

从斜面上挑取菌种，于含Na2SeO3量分别为0～50μg／mL的液体培养基中，根据所测得的生物量及硒多糖产量确定适宜硒浓度。

1.2.1.2 最佳加硒时间和培养时间的确定

通过测定耐硒菌生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间，测发酵液在600nm处吸光度值，用苯酚－硫酸法测定多糖含量，并绘制曲线。

1.2.2 硒多糖提取纯化

提取粗多糖：种子培养基→发酵培养基→发酵液离心，取上清→醇沉→离心→溶解→Sevag法除蛋白3次→醇沉→离心→溶解→透析→冷冻干燥→粗多糖。用苯酚－硫酸法测定多糖含量。

纯化粗多糖：粗多糖溶液→DEAE－52，NaCl梯度洗脱(体积流量0.5mL／min)→浓缩、透析、冻干→Sephadex G－100，蒸馏水洗脱→浓缩、透析、冻干→纯品多糖[5]。

1.2.3 富硒多糖含硒量的测定

采用石墨炉原子吸收法测定富硒多糖中的硒含量[6]。

1.2.4 富硒多糖流变性

1.2.4.1 浓度对多糖溶液黏度的影响

将Se－EPS和EPS配制成质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的多糖溶液，各取30mL，用SNB－1数字式黏度计测其在室温、40r／min条件下的黏度。

1.2.4.2 剪切力对多糖溶液黏度的影响

配制 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0% 的 Se－EPS 和EPS溶液，各取30mL，室温下依次测定每种质量分数多糖溶液在转速为30、40、50、60r／min下的黏度。

1.2.4.3 温度对多糖溶液黏度的影响

配制8份质量分数为1%的Se－EPS和EPS溶液，分别在30～100℃恒温水浴锅中保温20min，冷却至室温，测定其在40r／min下的黏度。

1.2.4.4 pH对多糖溶液黏度的影响

配制9份质量分数为1%的Se－EPS和EPS溶液，分别将pH 调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，测定其在30℃、40r／min条件下的黏度。

2 结果与讨论

2.1 加硒量和加硒时间的确定

2.1.1 加硒量的确定

如图1可知，假单胞菌PT－8的吸光值随着硒浓度的增加而降低，因此硒浓度过高将抑制菌体生长，故选取Na2SeO3添加量为20μg／mL。

图1 硒质量浓度对生长量和硒多糖产量的影响Fig.1 The effect of concentrations of Se on growth and yield of Se－EPS

2.1.2 加硒时间的确定

如图2所示，耐硒菌在4～14h处于对数期，至30h到达了最大，24～36h可认为是菌株生长的稳定期，42h后开始进入衰亡期。从转化率和生产周期考虑，选择第6h添加硒，培养时间为48h。硒多糖产量为7.28g／L。

图2 PT－8菌株的生长曲线Fig.2 The growth curve of PT－8strain

2.2 富硒多糖的硒含量

由表1可知添加Na2SeO3为20～40μg／mL的Se－EPS的含硒量相近，浓度高抑制菌体生长。因此Na2SeO3质量浓度为20μg／mL最佳。

表1 不同质量浓度Na2SeO3所得Se－EPS的含硒量Tab.1 The selenium amount in Se－EPS of Na2SeO3 concentration

2.3 富硒多糖的流变性

2.3.1 浓度对黏度的影响

在剪切速率为40r／min时测定Se－EPS和EPS分别在不同质量分数下多糖溶液的黏度，结果如图3所示。多糖溶液的黏度会随着浓度的升高而升高，而且硒多糖黏度始终低于多糖浓度。可能是由于是多糖的羟基和氨基硒化后，分子间由氢键产生的作用力变小使硒多糖的黏度变小[7]。

图3 不同质量分数下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.3 The viscosity of Se－EPS and EPS in different mass fractions

2.3.2 剪切力对黏度的影响

测定Se－EPS和EPS依次在相应质量分数不同剪切速率下黏度，结果如图4、5所示。该硒多糖和多糖均为非牛顿流体，且为假塑性流体。同时发现硒多糖的黏度小于多糖黏度，可能是由于该多糖在硒化反应过程中分子发生裂解，分子质量变小使得黏度变小[8]。

2.3.3 温度对黏度的影响

在相同剪切速率40r／min、质量分数为1%的Se－EPS和EPS溶液，在不同温度下的黏度测定结果如图6所示。随着温度的升高，Se－EPS和EPS溶液的黏度逐渐降低，表明高温会破坏多糖原有的高级结构。

图4 不同剪切速率下胞外硒多糖的黏度Fig.4 The viscosity of Se－EPS at different shear behavior

图5 不同剪切速率下胞外多糖的黏度Fig.5 The viscosity of EPS at different shear behavior

图6 不同温度下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.6 The viscosity of Se－EPS and EPS at different temperature

2.3.4 pH对黏度的影响

剪切速率为40r／min、质量分数为1%的Se－EPS和EPS溶液在不同pH下黏度的变化如图7所示。溶液的表观黏度值在酸性时最大，推测该多糖是酸性多糖[9]。

图7 不同pH下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.7 The viscosity of Se－EPS and EPS at different pH

3 结 论

海洋假单胞菌PT－8发酵产胞外硒多糖与胞外多糖产量和流变性进行了比较。硒多糖经醇沉、脱蛋白、冻干得到产量为7.28g／L，远远高于胞外多糖的产量[10]。其中硒多糖纯度为79.67%，并且该多糖中的硒为256.7mg／kg。同时测定了该硒多糖的黏度。孙兰萍等[11]研究发现硒化后的多糖黏度降低是由于壳聚糖的羟基和氨基硒化后，分子间由氢键产生的作用力变小使硒化壳聚糖的黏度变小；另一个原因是壳聚糖在硒化反应过程中分子发生裂解，分子质量变小使得黏度变小。本实验也发现硒多糖的黏度低于多糖，推测可能是由于硒化后硒与多糖的结合是通过与氨基和羟基结合，分子间由氢键产生的作用力变小使硒多糖的黏度变小，也可能是多糖分子发生裂解。其具体的结合方式，有待于进一步研究。

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