饲粮棉籽粕水平对高峰期蛋鸭产蛋性能、蛋品质、血浆生化指标、卵巢形态及棉酚残留的影响

阮 栋 林映才 张罕星 陈 伟 王 爽

(广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业部动物营养与饲料(华南)重点开放实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640)

棉籽粕(CSM)作为棉籽榨油后的副产物，粗蛋白质含量高达40% ～45%，是畜禽重要的蛋白质饲料原料，但因含有对动物有毒的棉酚，影响了其在畜禽配合饲料中的应用。棉酚是一种不溶于水而溶于有机溶剂的黄褐色聚酚色素，按存在形式可分为结合棉酚(BG)和游离棉酚(FG)。BG无毒性，在动物消化道内大部分不被吸收而排出，小部分则会在体内分解成FG。FG的毒性主要与其所含的活性醛基和活性羟基有关，不仅对心脏、肝脏、肾脏等实质性器官及神经、血管有毒害作用，而且能与棉籽蛋白质中赖氨酸的 ε-氨基(ε-NH2)发生美拉德反应，降低其营养价值［1］。在当前蛋白质饲料资源紧缺的环境下，研究CSM在蛋鸭饲料中的合理应用技术对蛋鸭产业发展具有重要意义。Koyacic［2］报道，棉酚药理剂量具有抗氧化性，而产生致毒剂量时又具有促氧化作用。Basini等［3］研究发现，5～25 μg/mL的棉酚能抑制母猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌，抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性，导致超氧负离子产生增多，刺激血管内皮生长因子生成。Gamboa等［4-5］研究表明，棉酚在肉仔鸡血浆、肝脏、肾脏和肌肉中蓄积量随饲粮中FG含量增加呈线性升高趋势;杨茹洁［6］研究发现，在饲粮中添加25%未脱毒 CSM(饲粮中FG含量为179 mg/kg)对28～40周龄海兰商品蛋鸡产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、料蛋比、平均采食量及死淘率均无显著影响。等［7］在饲粮中添加15%的CSM(饲粮中FG含量为186 mg/kg)对1～42日龄罗氏308肉鸡血浆血红素、铁含量及红细胞压积值无显著影响。目前我国蛋鸭年存栏量已达到2亿羽，蛋鸭饲料中广泛使用CSM等非常规饲料，但用量缺乏科学依据。本试验通过研究饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭产蛋性能、血浆生化指标、蛋品质、卵巢形态及棉酚残留的影响，以确定产蛋高峰期蛋鸭饲粮中适宜CSM水平，旨在为中国蛋鸭饲粮中CSM的合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验在广东省农业科学院动物科学研究所花都蛋鸭试验基地进行，采用单因子随机分组试验设计，选用19周龄福建龙岩山麻鸭母鸭720只，随机分为6个组，每组4个重复，每个重复30只鸭。试验鸭地面平养(水域面积∶陆地面积为1∶3)，其他按常规操作规程进行。蛋鸭产蛋率达到80%以上时(试验鸭为19周龄)开始正式试验，试验期为3个月。试验期间日平均气温和湿度在18～32℃和45% ～72%变化，天气状况良好。

1.2 试验饲粮及设计

试验饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，各组饲粮CSM 水平分别为0(对照)、4.5%、9.0%、13.5%、18.0%和22.5%，并保持各组试验鸭饲粮营养水平一致，试验饲粮组成及营养水平见表1。试验饲粮的代谢能、粗蛋白质和钙的设定水平参照本课题组前期研究结果。

1.3 样品的采集与制备

试验鸭饲养3个月后，每重复选接近平均体重试验鸭2只，称活重后，每只翅静脉采血10 mL进行抗凝处理，3 000 r/min离心15 min，制备血浆，分装于Ep管中，-20℃冻存，待测血浆生化指标。采血后试验鸭颈部放血致死，用手术刀割取左叶肝和左肾前半端，切成2～3 mm厚，放入10%甲醛溶液中浸泡固定，用于组织病理切片分析。另各取2份肝、肾及胸肌装入样品袋，于-80℃冻存，备测FG含量。在高峰期第3个月初，从每个重复栏选取5枚未破损蛋(接近平均蛋重)共计120枚，做好标记，其中3枚用于测定蛋品质指标，另2枚蛋黄、蛋清分别合并制成1个样，待测蛋黄和蛋清中FG含量。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 产蛋性能

试验期间，各组间在正常采食量前提下所有栏试验鸭的采食量每天都保持一致，定量饲喂，准确记录给料量和剩料量，统计试验期间的平均日采食量。准确记录试验鸭每天的蛋重、产蛋数量及破蛋、畸形蛋数量和重量，统计产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、料蛋比、破蛋率、畸形蛋率。

1.4.2 蛋品质指标

蛋壳厚度用数显千分尺测定蛋钝端、中部和锐端，计算平均值;蛋壳强度、哈氏单位和蛋黄颜色采用强度仪和全自动蛋品分析仪(ORKA，北京天翔飞域仪器设备有限公司)测定，测定过程在48 h内完成。

1.4.3 血浆生化指标

试验鸭血浆中丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法;血浆还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量采用二硫代二硝基甲酸比色法;血浆总抗氧化能力(T-AOC)采用Fe2+与菲啉类形成稳固络合物比色法;血浆碱性磷酸酶(ALP)活性采用比色法，1 000 mL血浆37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位;血浆谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性采用赖氏法，均在紫外可见光分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司，UV-1601)上用南京建成生物工程研究所提供的相应试剂盒测定。

1.4.4 组织病理切片分析

将固定好的组织样品石蜡包埋，常规采用苏木精-伊红染色法，制作好的切片于反置显微镜下观察组织的病理变化，并记录和拍照。肝脏脂肪变性程度判定:随机选择10个低倍视野(100×)，确定肝小叶内含脂滴数/总细胞数百分比。

1.4.5 FG含量测定

饲料、组织、蛋黄、蛋清中FG含量参照Kim等［8］方法，采用高效液相色谱仪(Waters 2695，美国)测定。采用Waters XBridge C18柱(4.6 mm×250 mm×5μm)，柱温25℃，流动相为甲醇-水，每100 mL溶液含0.1 mL磷酸，流速0.8 mL/min，Waters 2489紫外检测器，检测波长为236 nm，检测限为1.0 mg/kg。棉酚对照品(批号111517-200001，规格20 mg)购自广州药品检验所。另外送1份组织、直肠内容物及蛋黄、蛋清至中国广州分析测试中心，采用SN 0535—1996所述方法检测FG含量。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.5 统计分析

试验数据采用SAS 8.1软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值表示，显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭产蛋性能的影响

由表2可见，与对照组相比，13.5%、18.0%和22.5%组显著降低了平均蛋重(P＜0.05)，22.5%组显著降低了平均蛋重和日产蛋重并显著提高了料蛋比(P＜0.05);饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭产蛋率、破蛋率、畸形蛋率无显著影响(P＞0.05)。

表2 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭产蛋性能的影响Table 2 Effects of dietary CSM level on laying performance of laying ducks at peak production

2.2 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭血浆生化指标的影响

由表3可见，与对照组相比，9.0%、13.5%、18.0%和22.5%组显著降低了血浆GSH含量和GSH/GSSG值;9.0%、18.0%和22.5%组显著提高了血浆MDA含量(P＜0.05)，各组血浆GSSG含量、T-AOC及GOT、GPT和ALP活性均差异不显著(P＞0.05)。

表3 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭血浆生化指标的影响Table 3 Effects of dietary CSM level on plasma biochemical parameters of laying ducks at peak production

2.3 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭蛋品质的影响

由表4可见，饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、哈氏单位、蛋黄颜色及蛋黄比均无显著影响(P＞0.05)。

2.4 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭肝脏、肾脏和卵泡形态的影响

试验进行3个月后，屠宰试验鸭，取肝脏和肾脏做切片分析。图1显示，对照组、4.5%和9.0%组肝脏组织小叶完整、肝细胞形态规则，肝脏汇管区、中央静脉周围仅可见少量肝细胞脂肪变性(1% ～5%)，未见坏死现象。13.5%、18.0%和22.5%组肝脏脂肪变性明显增加(10% ～70%)，肝窦间隙增大，汇管区出现组织纤维增生，并出现淤血，随着饲粮CSM水平递增趋于严重。

表4 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭蛋品质的影响Table 4 Effects of dietary CSM level on egg quality of laying ducks at peak production

图1 蛋鸭肝脏切片显微结构Fig.1 Microstructure of liver section of laying ducks(400×)

图2 显示，对照组试验鸭肾脏肾小管形态规则，无明显坏死脱落现象;4.5%组局部肾小管上皮细胞空泡变性约1%～5%;9.0%组局部可见肾小管上皮细胞坏死灶，肾小管上皮细胞脱落严重，局部出现纤维组织增生;13.5%组肾小球出现萎缩，肾间质有淤血;18.0%和22.5%组肾小管细胞出现大面积坏死脱落，并形成钙化灶。

图3显示，对照组和4.5%组卵巢中优势卵泡形态规则，无明显异常病变。9.0%、13.5%、18.0%和22.5%组可明显观察到优势卵泡变形破裂、褶皱，卵泡血管壁有出血点，局部呈融溶状。

2.5 FG在蛋鸭胸肌、组织、直肠内容物及蛋中的残留

检测结果表明，在22.5%组试验鸭肝脏、肾脏、胸肌及蛋清、蛋黄中并未检测出FG残留，仅在试验鸭直肠内容物中检测到FG含量为4.55 mg/kg。

3 讨论

3.1 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭产蛋性能的影响

本试验结果表明，饲粮CSM水平≥13.5%时可显著降低平均蛋重，达到22.5%时可显著降低平均蛋重和日产蛋重并显著提高料蛋比。李建国等［9］选用43周龄海兰蛋鸡饲喂 FG含量为0、20、70、120 mg/kg的试验饲粮，结果表明，饲粮FG含量对产蛋率、蛋重影响不显著;当FG含量达到120 mg/kg时，采食量较对照组显著降低。Lordelo等［10］研究发现，饲粮含200 mg/kg的右旋异构体FG可显著降低34周龄海兰蛋鸡和44周龄科比快羽肉种鸡产蛋率，达到400 mg/kg时会降低采食量，而左旋异构体对试验鸡产蛋率无显著影响，仅降低快羽肉种鸡采食量。这说明高含量的FG会影响饲粮适口性，降低产蛋率和蛋重，不同异构体对禽产蛋性能有不同影响，且不同种属间对棉酚表现出耐受差异，相比蛋鸡，蛋鸭对棉酚的耐受性更差。

图2 蛋鸭肾脏切片显微结构Fig.2 Microstructure of kidney section of laying ducks(400×)

图3 蛋鸭卵巢形态Fig.3 Ovarian morphology of laying ducks

3.2 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭血浆生化指标的影响

GOT、GPT是氨基酸降解过程中的重要转氨酶，其中GPT主要存在于肝细胞胞浆内，以心脏和肝脏中的活性最高，而血清中活性很低，是反映肝细胞受损程度最敏感的指标，GPT活性增高主要由病毒性肝炎引起，而心脏功能不全或肝坏死则主要导致 GOT 活性增高［11］。Braham 等［12］指出，给断奶仔猪饲喂含228～440 mg/kg棉酚的CSM饲粮15周可以引起肝脏的损伤，导致血清GOT活性上升，但对血清GPT活性无显著影响;尹逊慧［13］试验表明，使用15%的CSM(饲粮FG含量为73.25 mg/kg)对1～20日龄樱桃谷肉鸭血清GOT、GPT及ALP活性无显著影响。曾秋凤等［14］采用棉籽饼粕等蛋白质饲料替代玉米-豆粕型基础饲粮中0、25%、50%、75%和100%豆粕(100%替代组CSM用量为23.27%，饲粮FG含量为156 mg/kg)饲喂14日龄樱桃谷肉鸭至35日龄，结果表明，各组间血浆GOT和GPT活性无显著差异。Ali等［15］给小鼠每日注射5 mg/kg的醋酸棉酚2周，除显著降低小鼠体重、肝脏 GSH含量和DNA酶，提高α-葡萄糖苷酶和RNA酶外，对血清GOT和GPT活性无显著影响。本试验结果表明，使用 22.5%的 CSM(饲粮 FG含量为50.16 mg/kg)对高峰期蛋鸭血浆GOT和GPT活性无显著影响，结合肝脏切片结果，说明除高饲粮CSM水平组蛋鸭肝脏肝细胞出现明显脂肪变性外，未对其肝功能造成明显破坏作用，这与曾秋凤等［14］推测肉鸭对饲料棉酚的敏感性高于肉鸡，且病理表现形式或靶器官可能不一致结果相符。但关于鸭对饲料棉酚的耐受性及残留和消除规律目前并未见报道研究，且研究深度不够，仅停留在CSM对鸭生长性能的影响。GSH是一种含量丰富的非蛋白巯基抗氧化物，能破坏过氧化氢、脂质过氧化物及氧自由基，保护机体免受氧化应激。MDA是由自由基引发一种高活性的脂质过氧化产物，组织内产生的自由基若不及时清除，会导致机体内MDA含量升高。T-AOC是用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标，它的大小可以代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态。Koyacic［2］报道棉酚药理剂量具有抗氧化性，而产生至毒剂量时又具有促氧化作用。倪鸣等［16］探讨了醋酸棉酚对小鼠黄体细胞凋亡的影响，结果表明醋酸棉酚可以直接损伤小鼠黄体细胞，产生明显的细胞毒性，且这种毒性作用与棉酚剂量呈正相关;SOD活性与孕激素含量随着棉酚剂量的增高而降低，而MDA含量变化趋势与此相反。赵萍［17］报道，给雄性细毛羊饲喂含棉籽壳的饲粮8个月能显著提高血清、肝脏中MDA含量，降低GSH含量、T-AOC和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。认为棉酚造成了雄性细毛羊血清和肝脏的氧化损伤。本试验中，饲粮CSM水平≥9.0%时显著降低了血浆GSH含量和GSH/GSSG值，并提高了MDA含量，但对T-AOC无显著影响。这说明饲粮CSM水平过高会对蛋鸭机体的氧化还原平衡体系有不利影响。

3.3 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭蛋品质的影响

本试验中高达22.5%的饲粮CSM水平(饲粮FG含量为50.16 mg/kg)对高峰期蛋鸭蛋品质无显著影响。杨茹洁［6］研究发现，当饲粮中FG含量高于100 mg/kg后蛋鸡蛋黄出现绿黄，蛋白颜色浑浊，煮熟后蛋黄变硬。刘锦湖［18］试验表明，蛋鸡饲粮FG含量达到55.85 mg/kg时，鸡蛋常温保存3周蛋黄出现斑点微杂色，随着时间延长出现红棕色，这可能是棉酚与铁离子结合，形成螯合物导致。高布潜等［19］研究证实，蛋鸡饲喂CSM 引起鸡蛋变色主要是由于CSM和棉油中不饱和脂肪酸易被氧气氧化变为环丙烯脂肪酸所致。环丙烯脂肪酸可以使卵黄膜通透性增高，卵黄中的铁离子可以渗透到蛋清中并与蛋清中的蛋白质形成红色复合物，使蛋清变红。同时，环丙烯脂肪酸可以使蛋黄变硬，加热产生“橡皮蛋”。关于影响蛋品质的FG的限量，国外学者推荐蛋鸡饲粮中最高允许量为20 mg/kg。因此，添加适量的CSM对蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度等蛋的外在品质无显著影响，但其抗营养因子对储存期或腌制期的蛋黄、蛋清品质的影响仍需进一步深入系统研究。

3.4 饲粮CSM水平对高峰期蛋鸭组织FG残留的影响

FG对畜禽有毒害作用，吸收入血后能损害心脏、肝脏、肾脏、生殖器官等实质器官，可导致心力衰竭，引起肺水肿和全身缺氧性变化，还能增强血管壁通透性，使受害组织发生浆液性浸润和出血性炎症以及体腔积液［20］。棉酚主要代谢场所是肝脏，主要随同粪便排出体外，其次经尿液排出。由于排泄缓慢，因此在体内有明显的蓄积作用。Abou-Donia等［21］利用14C放射追踪的方法研究了狗、鼠和猪体内棉酚排出情况，发现大部分棉酚都可以通过粪便排出体外。Gamboa等［4］采用不同榨油工艺的CSM(FG含量为0.033%～0.180%，总棉酚含量为0.974% ～1.459%)，添加水平为28%，研究棉酚在1～21日龄肉仔鸡组织中的沉积规律发现，棉酚异构体(左旋和右旋)在试验鸡血浆、肝脏、肾脏和肌肉中蓄积量随饲粮中FG含量增加呈线性升高趋势。肝脏中TG含量为71.4～313.6μg/g DM，显著高于肾脏的9.2～36.3μg/g DM、血浆中的3.0～14.6μg/mL和肌肉中的 2.1 ～9.8 mg/kg DM。Lordelo 等［10，22］研究表明，3～21日龄肉仔鸡饲粮 FG含量达到100 mg/kg时，试验鸡肝脏、肾脏和肌肉中FG含量分别为61、9和2 mg/kg DM;同时对36周龄海兰蛋鸡饲喂含200、400 mg/kg FG的饲粮至第3周时发现其蛋黄中FG含量分别达到235、386 mg/kg DM，肝脏、肾脏和鸡肉中FG含量分别为243、43和6 mg/kg DM。这说明，棉酚在动物体内各组织器官中残留是不均匀的，肝脏最多，其次是蛋、肾脏和血液，肉中最低。近年来，食品安全正逐渐成为人们日益关注和重视的问题。美国食品及药品管理局规定食品中FG残留不超过0.045%，前苏联国家标准为不超过0.01%［23］，我国《国家卫生标准》(GB 2716—88)规定棉籽油FG含量不超过0.02%。这些标准说明了FG在食品中限量缺乏一致标准，而我国除了对棉籽油FG含量有规定外，并没有对其他食品中FG含量作出规定，对于市场上畜产品中FG残留量并不清楚。本试验中饲粮CSM水平达到22.5%时(饲粮FG含量为50.16 mg/kg)，在蛋鸭肝脏、肾脏、胸肌、蛋黄、蛋清中未检测出FG残留，仅在直肠内容物中检出FG含量为4.55 mg/kg。但肝脏已出现明显脂肪变性，肾脏肾小管大面积坏死脱落，并形成钙化灶。这说明FG摄入量在机体的耐受范围内可被机体代谢掉，但仍可对器官造成病理性损伤，并且饲粮CSM水平达到9.0%(饲粮FG含量为28.03 mg/kg)即可明显破坏优势卵泡的完整性，卵泡变形破裂，局部呈融溶状，卵泡血管壁出现出血点;而棉酚作为血管毒素，可与血红蛋白结合。龙安梅［24］试验证实，醋酸棉酚在低剂量下能抑制猪原代培养黄体细胞的增殖和诱导其凋亡，高剂量下除诱导细胞凋亡外，主要对细胞产生细胞毒性。Oliver等［25］、Xu 等［26］试验证实，左旋棉酚可以通过线粒体依赖性细胞凋亡通路和配体-受体激活的Caspase依赖性细胞凋亡通路诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长。陈文飞等［27］研究表明，醋酸棉酚可通过降低抑癌基因甲基化诱导细胞凋亡，介导抗肿瘤作用。因此，推断棉酚在低剂量(FG含量为28.03 mg/kg)时可能诱导了蛋鸭卵巢黄体细胞的凋亡，故在制定蛋鸭畜产品安全限量时需充分考虑其影响。

4 结论

在本试验条件下，综合产蛋性能、抗氧化性能、组织病理分析及棉酚残留结果，产蛋高峰期蛋鸭饲粮CSM适宜水平需低于9.0%。

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