1株高产γ-聚谷氨酸菌株的选育及培养基筛选

李培培， 张万旭， 汪 强， 谭金芳， 韩燕来

(河南农业大学资源与环境学院，河南 郑州 450002)

1株高产γ-聚谷氨酸菌株的选育及培养基筛选

李培培， 张万旭， 汪 强， 谭金芳， 韩燕来

(河南农业大学资源与环境学院，河南 郑州 450002)

从腐乳中分离筛选出1株产γ-PGA的菌株pga-1，经过菌落形态、革兰氏染色显微成像及细菌16Sr DNA基因序列分析，确定其为枯草芽孢杆菌(Bacdllussubtilis).对该菌的抗逆性、生长及发酵最佳培养基进行初步的研究和筛选.结果表明，经过3个月的冷冻保藏后该菌生长旺盛，表现较强的抗逆性和稳定性；摇瓶发酵产物纯化后经酸水解、高压液相色谱检测，表明其成分为单一谷氨酸，说明发酵产物为谷氨酸聚合物；用5种培养基进行最优种子培养基和发酵培养基筛选，表明培养基A生长量最大，为最佳种子扩繁培养基；富含谷氨酸钠的培养基C为最佳发酵培养基,发酵72 h后，γ-聚谷氨酸的产量最高达到28.9 g·L-1.

γ-PGA菌株；培养基；生长曲线；产量

聚谷氨酸(γ-PGA)由L-谷氨酸(L-Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)单体通过酰胺键聚合而成的一种多肽分子[1]，其特殊的化学结构使其具有优良的保水性能，在农业上可用作保水剂.与传统聚丙烯酰胺类化学保水剂相比，γ-PGA的吸水性能和保水性能要高1倍以上，能显著提高干旱土壤种子发芽率[2]，且该种材料具有高度可生物降解性，其降解产物谷氨酸是植物生长的营养物质，有利于土壤微生物和作物根系的吸收和利用，不会造成环境污染和不良的生态效果，是最具发展前景的生物材料之一[1].随着中国干旱缺水问题的日趋加剧，水资源越来越成为制约农业可持续发展的重要因素.γ-PGA主要用在医药、化工材料等方面，在抗旱节水方面的研究应用国内并不多见，日本科研人员采用γ-PGA吸水树脂包裹牧草种子，撒于缺水沙地进行绿化试验，1周后种子发芽生长良好[3,4].另外，在使用肥料、杀虫剂、除草剂等时，加入适量的γ-PGA盐可以延长它们在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、下雨而被冲刷掉.鉴于此，开展新型保水材料γ-PGA的开发和应用，为干旱缺水地区农业生产提供廉价高效的保水产品，具有重要意义.

γ-PGA最初在炭疽芽孢杆菌的荚膜成分里被发现，后经研究者不断努力，利用芽孢杆菌发酵培养获得纯化的γ-PGA[1]，微生物合成法与其他合成方法相比具有成本低廉、过程简单、周期短、产量高等特点.选育γ-PGA合成菌株的研究很多，但其研究目的同样多集中于医药、化工等产业方面的应用，而用于农业保水材料的开发研究还比较少[5,6].本研究有针对性地筛选出γ-PGA合成菌株，并对其生长条件和发酵产物进行了系统的表征和鉴定，筛选菌株最佳菌体生长和发酵培养基，以提高γ-PGA产率，为规模化生产生物保水产品提供参考.

1 材料和方法

1.1目标菌株筛选

分离菌种材料：腐乳(王致和)、土壤等.菌株的筛选采用以下的方法：取少量样品，用无菌生理盐水稀释，沸水浴5 min，放置冷却.取上清液稀释后吸取0.1 mL涂布于LB平板(酵母粉10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCI 5 g·L-1，pH值为7.0～7.2，固体加琼脂粉20 g·L-1，0.1 mol Pa灭菌20 min)，于37 ℃培养箱，培养观察24 h.挑选形态大、表面光滑、高黏湿润的单菌落进行连续的划线培养，最终获得纯菌株.

1.2菌株鉴定

1.2.1 菌株形态特征 连续划线培养获得纯菌株，观察菌落形态.挑取LB平板上少许菌体接种至LB液体培养基，于37 ℃ ，200 r·min-1振荡培养14 h，菌液进行革兰氏染色，用显微镜(Nikon Eclipse 80i，日本)观察并拍照.

1.2.2 细菌16Sr DNA鉴定 取5 mL培养24 h的菌液，8 000 r·min-1离心10 min，收集细胞，弃上清液，沉淀物提取微生物总DNA[7].用引物对27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)扩增细菌的16Sr DNA序列全长，反应体系参照takara产品Taq酶说明书.PCR反应条件：94 ℃预变性10 min， 94 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26个循环；最后72 ℃延伸10 min.扩增产物用质量分数1.5%的琼脂糖电泳检测目标条带.

PCR产物经纯化，由华大基因有限公司完成16Sr DNA的双向测序，测序结果用DNA star软件进行拼接，在NCBI数据库中进行核苷酸序列的Blast比对，得到相关菌株的16Sr DNA基因的核苷酸序列，利用MEGA 5.0软件NJ(Neighbour Joining)法构建系统进化树.

1.3培养基及培养条件

1.3.1 培养基 A：葡萄糖30 g·L-1，酵母膏8 g·L-1，三水磷酸氢二钾2 g·L-1，硫酸镁0.25 g·L-1， 谷氨酸钠30 g·L-1，pH值7.5.

B:葡萄糖 54 g·L-1，硫酸铵9 g·L-1，三水磷酸氢二钾2 g·L-1，硫酸镁0.25 g·L-1， pH值7.5.

C: 酵母粉30 g·L-1，葡萄糖50 g·L-1，氯化铵7 g·L-1，谷氨酸钠50 g·L-1，三水磷酸氢二钾2 g·L-1， 硫酸镁0.25 g·L-1，pH值7.0～7.5.

D: 柠檬酸10 g·L-1，谷氨酸钠30 g·L-1，甘油80 g·L-1，氯化铵7 g·L-1，磷酸氢二钾0.5 g·L-1，六水三氯化铁0.05 g·L-1，二水氯化钙0.15 g·L-1，七水硫酸镁0.5 g·L-1，一水硫酸锰0.1 g·L-1，pH值7.0～7.5.

E: 葡萄糖 50 g·L-1，硫酸铵 2 g·L-1，硫酸镁0.6 g·L-1，磷酸二氢钾 6 g·L-1，磷酸氢二钾 14 g·L-1，加2 mL微量元素.微量元素配方：硫酸亚铁、氯化钙、硫酸锰和硫酸锌各1 mmol，pH值7.0～7.5.

1.3.2 培养方法 (1)种子培养：取活化菌种一环，接种于种子培养基，37 ℃，200 r·min-1，振荡培养24 h.

(2)发酵培养：取1%种子培养液接入到装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃，200 r·min-1，振荡培养84 h.

1.3.3 菌种保存 将筛选得到的菌株接入LB液体培养基，取对数生长期末期的菌液0.8 mL加入已高压灭菌的含0.2 mL甘油的保存管中，-80 ℃保藏.

1.3.4 不同培养基条件下菌体生长特征 分别在250 mL三角瓶中配制50 mL的A，B，C和D 4种液体培养基，121 ℃灭菌20 min，冷却后分别以0.5%的接菌量将菌液接种至液态培养基中，于37 ℃，200 r·min-1振荡培养24 h，每隔2 h取样检测菌体在OD660 nm下的吸光值，记录菌体的生长曲线.

1.3.5 菌株抗逆性及稳定性 将保存于-80 ℃的菌种取出，接种到种子培养基中，不同取样时间测定OD600下的吸光值，比较保存菌种与连续传代菌种的生长曲线.

1.4γ-PGA产物的定性测定

振荡培养48 h的几种培养基的发酵产物，参考文献[8]的方法进行目标产物的纯化和分离. 得到的样品用于后续的酸水解及液相色谱(Waters 515，美国)测定，具体步骤如下.

(1)取适量的样品到水解管，加5 mL的6 mol·L-1的盐酸到水解管中后，使用乙醇喷灯封口，110 ℃水解24 h，冷却后用6 mol·L-1的NaOH溶液调pH值至9.0左右后移至50 mL容量瓶中.用超纯水洗涤3次，定容，过滤后取滤液进行柱前衍生后，使用反相高效液相色谱法分析L-谷氨酸含量.

(2)色谱条件：色谱柱：Ultimate Amino acid，5 μm，4.6×250 mm；流动相A：V(0.1 mol·L-1醋酸钠溶液)∶V(乙腈)=93∶7，流动相B：V(水)∶V(乙腈)=20∶80，其中乙酸钠溶液用冰醋酸调节pH值6.5，流动相梯度洗脱程序见表1；柱温：40 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：5 μL.

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

(3)柱前衍生：精确量取上述水解液或L-谷氨酸标准液0.4 mL，置于离心管中，加入稀释后的衍生剂A液0.2 mL，衍生剂B液0.2 mL后摇匀，在50 ℃水浴锅中加热45 min取出，待温度降至室温后加入正己烷0.4 mL摇匀，并用孔径为0.45 μm有机膜过滤，放置30 min后，取澄清的下层液进行高效液相色谱分析.

1.5不同发酵培养基的产量研究

分别在0，24，48，60，72和84 h取样测定几种发酵培养基发酵产物中γ-PGA的产量.经上述纯化分离后，冷冻干燥称重.

2 结果与分析

2.1菌株形态特征

经过连续的划线培养，从3株外观大而黏稠的菌株中选择生长最旺盛的1号菌株(图1-A)，菌体呈半透明状，表面光滑.对1号菌进行革兰氏染色显微镜成像，菌株呈蓝紫色(图1-B)，为革兰氏阳性菌，形态为杆状.

图1 菌落形态(A)及菌株革兰氏染色显微镜成像(B)Fig.1 Colony morphology of pga-1 (A) and micrograh (B)

2.2菌株16SrDNA序列分析

细菌16Sr DNA全长扩增测序后获得基因序列1 460 bp，见图2-A.与Genebank数据库中DNA序列进行比对，构建该菌株的系统发育树(图2-B).结果表明，菌株pga-1与枯草芽孢杆菌Bacillussubtilisstrain相似率最高，聚在一类，同源性高达99%，可将该菌定位为枯草芽孢杆菌.

图2 菌株16Sr DNA相对分子质量检测(A)和基于16Sr DNA序列的系统发育树的构建(B)Fig.2 Molecular of 16Sr DNA sequence (A) and phylogenetic tree of bacteria based on the 16Sr DNA sequence (B)

2.3发酵目标产物γ-PGA鉴定

A，B，C和D 4种培养基发酵48 h后，对4种培养基发酵样品中的酸水解产物进行定性的测定.其中培养基A的发酵物中，没有检测到谷氨酸，其余3种培养基发酵水解物中，目标产物的检出保留时间与谷氨酸标准品一致，保留时间5.502 min，如图3所示.表明发酵物中产物成分为谷氨酸聚合物，可以确定该菌株为聚谷氨酸产生菌，命名为pga-1.

几种培养发酵水解产物中谷氨酸的检出量分别为：A培养基为0 g·L-1,B培养基为1.74 g·L-1，C培养基为15.46 g·L-1，D培养基为10.65 g·L-1.以C和D培养基富含谷氨酸钠作为发酵培养基产量最高.

图3 高效液相色谱测定4种培养基发酵水解物中的谷氨酸含量Fig.3 Production of glutamic acid from hydrolysis of pga-1 fermentation using four medium detected by HPLC

2.4菌株在不同培养基条件下生长曲线

用A，B，C和D 4种不同的液体培养基进行培养，在24 h的培养时间内，从菌株的生长曲线中可以看出(图4)，培养基A生长量最大，在18 h达到最大值，之后进入衰亡期，开始有菌体发生自溶现象，造成吸光值下降.其次为培养基C，在16 h达到最大值，生长速度最快.在培养基B和D中培养细胞生长量较小.结果表明，培养基A最有利于该菌株细胞增殖，可以作为该菌株的种子培养基，以便种子扩繁，进行规模化发酵.

图4 不同培养基条件下菌株生长曲线Fig.4 Growing characteristics of pga-1 using four medium

2.5菌株抗逆性及稳定性

将连续转接传代的菌株与-80 ℃保存3个月的菌株进行生长曲线的比较，由图5可以看出，冷冻保存的菌株活力旺盛，不需要经过复壮，就能到达良好的生长能力，与连续传代菌株没有差异，表现较强的抗逆性和稳定性.该菌株便于保存，为进一步开发应用提供了前提条件.

图5 连续传代和冷冻保藏菌株的生长曲线Fig.5 Growth curves of continuous passage culture and freezing preservation

2.6不同培养基发酵产物产量

通过84 h内发酵产物γ-PGA的纯化和恒重测定，在相同的发酵条件下，前24 h几种培养基发酵产γ-PGA产量均比较低，产物量的高峰均出现在60 h以后.B培养基在60 h到达产量最大值8.0 g·L-1，C培养基在培养第72 h产量达到最大值28.9 g·L-1，D培养基在48 h产量达到最大值14.9 g·L-1，E培养基在24 h产量达到最大值14.6 g·L-1，如图6所示.由此可见，作为出发菌株，pga-1具有相当可观的产量，其中C培养基可以作为该菌株的优选培养基，进一步的菌株改造和发酵优化.

图6 不同培养基不同发酵时间γ-PGA产量动态Fig.6 Dynamics of γ-PGA production fermented using different medium at different time

3 讨论

本研究选育获得1株高产聚谷氨酸合成菌株pga-1，经形态分析和16Sr DNA序列鉴定为枯草芽孢杆菌，经研究其适宜的发酵培养基，摇瓶水平下最高产量达到28.9 g·L-1.目前γ-PGA菌株筛选研究较多，获得的菌株主要是芽孢杆菌属的细菌[9]， HEZAYEN等[10]报道的1株嗜盐古菌Natrialbaaegyptiacasp.也能产生γ-PGA，在生产中发酵产γ-PGA的2种主要菌株为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌.桑莉等[5]筛选到1株枯草芽孢杆菌在70 g·L-1的谷氨酸钠底物条件下，γ-PGA产量最高，达到18.32 g·L-1，姚俊等[11]从土壤中筛选到1株枯草芽孢杆菌，在富含谷氨酸和葡萄糖的培养基上摇瓶发酵最高产γ-PGA 26 g·L-1，还有研究者[12]采用射线诱变的方法对1株地衣芽孢杆菌进行改造并优化，其γ-PGA产量为18.9 g·L-1，国外报道的较好的γ-PGA出发菌株的最高产量也多在20～30 g·L-1[1,13].与前人研究相比，本研究获得的γ-PGA合成菌株发酵产量较高，且抗逆性强，经过菌株改造或发酵条件优化预期将获得更高的产量.

前人研究将γ-PGA产生菌分为2类，1类是谷氨酸依赖型，另一类是谷氨酸非依赖型[13，14]，而谷氨酸依赖型又可分为2小类，1类需大量谷氨酸才能合成γ-PGA；另一类只需少量谷氨酸就能合成γ-PGA,目前的研究多集中在谷氨酸依赖型菌株上[14].本研究所得菌株用含谷氨酸底物的培养基C和D发酵(底物谷氨酸钠含量分别为50 g·L-1和30 g·L-1)，γ-PGA的产量较高，其中50 g·L-1谷氨酸钠底物含量的C培养基中产量最高.培养基B和E中尽管无谷氨酸底物，也能合成少量的γ-PGA，可以判断该菌株为谷氨酸非依赖型合成菌，且可以被谷氨酸钠诱导使产量提升.尽管非依赖型菌株比依赖型菌株合成产量低得多，但由于发酵培养基中无需添加谷氨酸底物，大大降低了生产成本，日益为研究者所关注，摇瓶水平下非依赖性菌株的合成产量也达到了可观的水平[14，15]，这也为非依赖型γ-PGA微生物合成工业化生产提供了可能.因此在以后的发酵试验中，将重点研究菌株pga-1对谷氨酸前体依赖程度及提高合成产量，选择成本低廉的底物进行发酵调控，为降低γ-PGA作为保水剂产品的投入，并为罐上发酵提供数据参考.

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(责任编辑：朱秀英)

Screeningofaγ-Polyglutamicacidstrainanditsculturemediumoptimization

LI Pei-pei, ZHANG Wan-xu, WANG Qiang, TAN Jin-fang, HAN Yan-lai

(College of Resource and Environmental Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to produce γ-Polyglutamic acid ( γ-PGA), a γ-PGA strain was isolated from preserved beancurd．The strain was identified asBacillussubtilisthrough morphological identification and 16Sr DNA sequencing analysis．γ-PGA qualitative and strain resistance were analyzed, and the best medium for cell growth and γ-PGA yield were selected. Acid hydrolysis of the fermentation detected by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) showed that glutamate was the single production, and there was no significant change of the growth curve of the strain after cryopreservation for 3 months. Medium selection was investigated in the shake culture, and the results showed that medium A was best for cell growth and medium C rich in sodium glutamate was best for γ-PGA fermentation with the highest production of 28.9 g·L-1.

a γ-Polyglutamic acid strain; medium; growth curve; production

Q 939.9

：A

2013-11-05

河南省科技攻关计划项目(132102110038)；河南省教育厅自然科学基金项目(13A210496)；“十二五”农村领域国家科技计划(2012BAD05B0207)

李培培，1982年生，女，河南开封人，讲师，博士，主要从事资源微生物方面的研究.

韩燕来,1965年生，女，河南驻马店人，教授，硕士研究生导师.

1000-2340(2014)05-0631-06