超声波辅助提取榴莲果皮总黄酮及其抗氧化、抗菌活性的研究

洪 军， 杜海霞, 胡建业

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.周口职业技术学院，河南 周口 466000)

超声波辅助提取榴莲果皮总黄酮及其抗氧化、抗菌活性的研究

洪 军1， 杜海霞2, 胡建业1

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.周口职业技术学院，河南 周口 466000)

榴莲果皮；总黄酮；抗氧化能力；抗菌活性

黄酮类化合物具有低毒甚至无毒的药用成分，具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗病毒、抗菌抗氧化、延缓衰老等作用[1～3]，是国内外医药、食品及化妆品等领域的研究热点.榴莲作为一种热带水果，营养价值极高，除了含有常规的营养素之外，还含有黄酮类物质、花青素、黄烷醇等生物活性物质.据报道榴莲果皮中也含有相似的有效成分.目前国内外对榴莲壳果皮中总黄酮的种类及结构、活性方面研究较少.因此，本研究从开发利用废弃榴莲皮资源出发，对榴莲果皮中主要生物活性物质——黄酮进行提取优化，并对其抗氧化和抑菌活性进行研究，为榴莲果皮的综合利用和新产品的开发提供一定的理论支持.

1 材料与方法

1.1材料和主要仪器

金枕榴莲：购于平顶山市丹尼斯超市.芦丁标准品购于上海源叶生物科技有限公司；主要试剂：亚硝酸钠，硝酸铝，无水乙醇，氢氧化钠，邻苯三酚，过硫酸钾，ABTS， VC等均为分析纯.

主要仪器：KQ5200DB型数控超声波清洗器；KDC-16H型低速离心机；旋转蒸发器RE-52A；HZQ-F160型全温振荡培养箱；T6新世纪型紫外可见分光光度计；低温冷冻干燥机.

1.2试验方法

1.2.1 原料处理 新鲜榴莲皮用蒸馏水冲洗干净，切片，放入烘箱60 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用.

1.2.2 榴莲果皮中总黄酮含量的测定 以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，利用分光光度计在波长为510 nm下测定其黄酮含量[4].试验测得标准曲线回归方程为:Y=0.469 5X-0.010 0，相关系数R2=0.999 1.根据标准曲线回归方程，由吸光度求出提取液中的芦丁含量，按下式计算出待测样中总黄酮的含量.

总黄酮的提取量m1(mg)=C×V1×V2

总黄酮的得率=m1/m2×100%

式中：C为测得吸光值带入回归方程计算出所对应的总黄酮质量浓度(g·L-1)，V1为总黄酮提取液体积(mL)，V2为测量总黄酮含量时的定容体积(mL)，m2为榴莲果皮样品重量(mg).

1.2.3 超声波辅助提取榴莲果皮总黄酮的单因素试验及正交试验优化 分别选取不同的乙醇体积分数、料液比、提取时间进行单因素试验，考察各单因素对榴莲果皮总黄酮提取率的影响.在单因素试验的基础上，然后进行3因素3水平正交试验，最终达到优化榴莲果皮中总黄酮提取条件，获得最优的提取条件.采用优化工艺提取的榴莲果皮中黄酮类物质，浓缩干燥后冷藏保存，用于抗氧化活性和抑菌活性的测定.

1.2.4 黄酮的抗氧化活性测定

1.2.4.2 黄酮、VC对ABTS+(2, 2-联氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐)自由基的清除活性测定，VC作为对照，参考文献[6]方法进行.

1.2.5 采用琼脂平板孔穴扩散法测定榴莲果皮中黄酮的抑菌活性 黄酮粗提取液的制备： 称取黄酮粗提取物的适量干粉，用10%乙醇配成溶液，并用滤膜过滤除菌.分别取制备好的4种供试菌悬液(106个· mL-1)100 μL均匀涂布琼脂平板，然后在平板上打孔，孔穴直径为6 mm，每孔穴加入不同质量浓度的黄酮粗提取液50 μL，同时以抗生素和10%乙醇作对照，分别在相应适合温度下培养24 h后，测量孔穴周围抑菌圈直径，用以表示抗菌活性(抗菌活性=抑菌圈直径-6 mm).

2 结果与分析

2.3单因素试验

2.3.1 料液比对榴莲果皮总黄酮提取率的影响

在160 W功率下超声萃取时间50 min, 60%的乙醇，提取温度60 ℃条件下，分别测定料液比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60对榴莲果皮总黄酮提取率的影响.结果如图1所示.

图1 料液比对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of material-to-liquid ration on the extraction rate of total flavonoids

由图1可知，料液比从1∶10到1∶30时，黄酮提取率增长较快，当料液比超过1∶30时黄酮的提取率逐渐减小，料液比达到1∶50后，提取率趋于平稳.可能的原因是随着溶剂量的增加，质量浓度梯度增大，总黄酮溶出速率和含量变大.当总黄酮充分溶出后，即使继续加大溶剂量，总黄酮的提取率基本趋于稳定.在实际操作中考虑总黄酮的充分溶出同时也避免溶剂的浪费.因此选择料液比为1∶30为最佳料液比.

2.3.2 提取时间对榴莲果皮总黄酮提取率的影响

在160 W功率下60%的乙醇，料液比为1∶30，提取温度60 ℃条件下，分别测定提取时间为 30，60，90，120，150 min对榴莲果皮黄酮提取率的影响.结果如图2所示.

图2 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由图2可知，超声提取时间在30～60 min，黄酮提取率随着时间的延长而缓慢增大，提取时间超过60 min，黄酮的提取率随着时间的延长逐渐减慢至平稳，因此选择60 min为最佳提取时间.

2.3.3 乙醇体积分数对榴莲果皮总黄酮提取率的影响 在160 W功率下超声提取60 min，料液比为1∶30，提取温度60 ℃条件下，分别测定乙醇体积分数为30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%对榴莲果皮黄酮提取率的影响.结果如图3所示.

图3 乙醇体积分数对榴莲果皮中总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由图3的结果表明，乙醇体积分数在30%～70%时总黄酮的提取率呈增长趋势，乙醇体积分数超过70%后总黄酮提取率呈下降趋势，在乙醇体积分数为70%时总黄酮提取率最大.因此选择70%乙醇为最佳提取体积分数.

2.4乙醇体积分数、液料比及超声时间互作对榴莲果皮总黄酮提取的影响

在单因素试验的基础上，进一步考察乙醇体积分数、液料比和超声时间对榴莲果皮的总黄酮提取效果的影响.采用3因素3水平的正交实验分析法，对超声波提取条件进行优化，试验设计及结果见表1和表2.不同的工艺条件总黄酮得率存在一定的差异，最高得率是最低得率的 1.54倍.极差分析结果可知，4种因素对总黄酮得率的影响大小顺序为超声提取时间>乙醇体积分数>料液比.最佳提取组合是：提取时间60 min，乙醇体积分数70%，料液比1∶30，在提取功率160 W，提取温度60 ℃条件下，提取率最高可达3.142%，此黄酮提取率较李娜[7]报道有所提高，无阮尚全等[8]报道高.

为进一步验证正交试验的结果及重现性，在最优条件下进行5次平行试验，平均提取率为3.142%, RSD为0.76%，表明该试验设计合理可行，重现性好，工艺稳定.

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results

2.5榴莲果皮中总黄酮的抗氧化活性测定

图4 黄酮对自由基的清除活性Fig.4 Scavenging ability of flavonoids from durian peel on Superoxide anion radical

2.5.2 黄酮对ABTS+清除能力的测定 ABTS+清除能力的测定常用来评估各种复合物或单一复合物总抗氧化的能力[9].由图5可知，榴莲果皮总黄酮提取物及VC对ABTS+清除能力随着质量浓度的增加而增加，榴莲果皮总黄酮提取物对ABTS+清除能力与VC相当.

2.6榴莲果皮中总黄酮的抗菌活性分析

从表3可知，榴莲果皮黄酮粗提物对不同细菌

的抑菌活性有一定的差异，在相同的质量浓度1.25～10 g·L-1下，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最明显，绿脓杆菌次之，而对大肠杆菌和巨大芽胞杆菌均无抑制作用(表中未标出).此结果表明，榴莲果皮中黄酮类物质的抑菌作用的强弱具有选择性.但具体的黄酮类物质的种类及各自的含量有待进一步探究.

图5 黄酮对总ABTS+的清除活性Fig.5 Scavenging ability of flavonoid from durian peel on ABTS radicals

注：在此试验中，黄酮提取物质量浓度按粗提取物质量浓度计算，直接称量黄酮粗提物质量;上述所用黄酮提取物质量浓度对巨大芽孢杆菌CICC 0.217和大肠杆菌 ATCC25922均无抑菌圈，因此未标注.

Note: In this experiment, the flavonoid crude extract concentration was determinated according to the mass concentration of crude extract flavonoids. The crude extract flavonoids showed no antimicrobial circle onEscherichiacoliandBacillusmegateriumin this concentration, so it was not marked.

3 结论与讨论

关于黄酮的提取工艺方面，目前报道的有阮尚全等[8]在乙醇-硫酸铵双水相中，采用超声波法探讨了提取榴莲果皮中总黄酮的最佳工艺，使得总黄酮的提取率达3.26%.李娜等[7]利用超声波乙醇浸提法，采用响应面设计，研究了榴莲皮中的总黄酮提取工艺，在此最佳工艺中总黄酮的提取率达到3.00%.而本研究中，采用超声波辅助法在最佳工艺下总黄酮提取率为3.14%，较李娜等报道的工艺有所提高，无阮尚全等在乙醇-硫酸铵双水相中提取率高，但本研究提取方法简便，快速，易于掌握.关于来源于其它提取物的黄酮对革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌的抑菌作用均有报道，如甘草[10]和红薯茎叶中的黄酮[11]，也有一些关于抗氧化的活性报道，如川芎[12]、烟草[6]以及石参中的总黄酮[13].结合本研究表明，不同来源的黄酮提取物对不同的微生物及抗氧化能力均有差异，可能与其黄酮的种类及结构不同有关.本研究为榴莲果皮的开发利用提供理论支持，同时也为榴莲果皮总黄酮的抗氧化和抗菌活性提供理论依据.

[1] LAGHARI A Q, MEMON S, NELOFAR A. Extraction, identification and antioxidative properties of the flavonoid-rich fractions from leaves and flowers ofcassiaangustifolia[J]. American Journal of Analytical Chemistry, 2011, 2(8): 871-878.

[2] Middleton E J. Effect of plant flavonoids on immune and inflammatory cell function[J]. Adv Exp Med Bio, 1998, 439:175-182.

[3] CUSHNIE T P, LAMB A J. Antimicrobial activity of flavonoids [J]. International journal of antimicrobial agents, 2005, 26(5): 343-356.

[4] 郭 君, 罗跃中. 三七中总黄酮提取工艺研究[J]. 食品工程, 2010(3):34-37.

[5] 赵 平, 任 鹏, 张月萍. 原花青素抗氧化活性测定方法比较[J].现代化工, 2012, 32(05): 119-122.

[6] RU Q M, WANG L J, LI W M, et al. In Vitro antioxidant properties of flavonoids and polysaccharides extract from tobacco (NicotianatabacumL.) leaves [J]. Molecules, 2012, 17: 11281-11291.

[7] 李 娜, 董 明, 张国庆, 等. 响应面法优化榴莲皮中总黄酮的提取工艺[J]. 食品工业科技, 2011, 32(9): 325- 328.

[8] 阮尚全, 王志鹏, 黄雀宏, 等. 双水相-超声波提取榴莲果皮总黄酮的工艺研究[J]. 现代食品科技, 2012, 28(12):1722-1725.

[9] WU S B, WU J, YIN Z, et al. Bioactive and marker compounds from two edible dark-colored myrciaria fruits and the synthesis of jaboticabin[J]. Journal agriculture and food chemistry, 2013, 61: 4035-4043.

[10] 崔永明, 余龙江, 敖明章, 等. 甘草总黄酮的提取技术及其抑菌活性研究[J]. 中药材, 2006(8): 838-841.

[11] 张锡彬, 张 彧, 高荫榆, 等. 红薯茎叶黄酮提取物抑菌活性的研究[J]. 食品科技, 2008(1): 156-159.

[12] WANG X S, WU Q N, WU Y F. Response surface optimized ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from sparganii rhizoma and evaluation of their in vitro antioxidant activities[J].Molecules, 2012, 17: 6769-6783.

[13] 罗 超,刘霭明,邢惟青,等. 石参总黄酮抗氧化活性研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(7): 198-201.

(责任编辑：朱秀英)

Ultrasonic-assistedextractionofflavonoidsfromdurianpeelandtheirantioxidantandantimicrobialactivities

HONG Jun1, DU Hai-xia2, HU Jian-ye1

(1.College of Life Science and Engineering, Henan University of Urban Construction, Pingdingshan 467036, China; 2.Zhoukou Vocational and Technical College, Zhoukou 466000, China)

Ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from durian peel and their antimicrobial and antioxidant activities were first investigated. Single-factor and orthogonal experiment were used to investigate the optimum extraction conditions. The results showed that, the combination of 70% ethanol, material-to-liquid ratio of 1∶30(g·mL-1), 60 min ultrasonic extraction were optimal extraction condition with the highest yields of flavonoids from durian peel at 40 kHz/200 W. Under this optimal extraction condition, the extraction rate was 3.142%. Besides, flavonoids from durian peel had similar scavenging activities on ABTS and superoxide anion compared with VC. Meanwhile, the flavonoids from durian peel had obvious inhibitory effect onStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa, but they had no effect onEscherichiacoliandBacillusmegaterium.

durian peel; flavonoids; antioxidant activity; antimicrobial activity

TS 202

：A

2013-11-24

河南城建学院博士启动基金项目.

洪 军，1977年生，女，河南商丘人，博士，讲师，主要从事活性物质的提取及多肽的作用机理研究.

1000-2340(2014)05-0653-05