水样发光细菌急性毒性测试的方式与表征

孙成华，刘 康，衡丽娜，刘保献

北京环境保护监测中心，北京 100048

对排放物毒性的评价和控制的经典方法是对特定化学物质的指标监测和限制，如工业废水的评价和控制主要围绕综合指标(BOD5、COD、DOC、TN、TP等)和单一的有毒有害指标(如典型重金属、有毒有害的特定有机物)开展，但是这些指标的监测和评价均存在一定的局限性［1］。一方面，实际的环境样品中可能存在很多未知的化合物，对于综合性样品的研究表明，特异性化学分析测定未知样品的毒性仅占毒性检测的20%;另一方面，毒性效应是所有组成物质协同或拮抗作用的综合结果，李专等［13］对工业废水的研究表明，部分企业排放的化学指标合格的废水对生物还具有不同程度的毒性，所以单纯化学物质的监测和限定不能为水体的安全提供充分的保障。生物毒性试验应用“黑箱”方法，它不是揭示水中含有哪些污染物以及确定污染物浓度，而是综合反映废水对生物毒性的大小及危害程度。目前，许多国家已应用生物学方法对排放物毒性进行测定和评价，从而最终判定环境样品的综合毒性效应。对环境样品进行生物毒性测试是化学分析的必要补充和延伸。

发光细菌毒性检测技术基于在一定实验条件下发光细菌发光强度恒定，任何毒性物质抑制其正常代谢，都会导致发光强度的减弱，毒性越强，对代谢的抑制作用越强，发光被抑制得越厉害的原理。该技术是目前国际上研究最多的毒性检测技术，有国际、国内标准支持［5-11］。

美国、加拿大、德国等发达国家早在20世纪七八十年代就已经开始实施废水综合毒性控制，并制定了相应的毒性控制标准［1］。德国水管理法(WHG)明确规定了废水排放的发光细菌毒性限制值，填埋场渗出液、工业冷却水、化学工业的废水的稀释因子(GL) 分别为 4、12、32［1］。2008年起，中国对发酵类制药行业也开始实施发光细菌毒性控制管理，标准限值采用等效氯化汞的质量浓度［1］。为了解不同类型的环境样品对发光细菌的毒性状况，应用费氏弧菌(Vibrio fischeri)，依据 ISO 11348-3［10］费氏弧菌冻干法，从环境质量样品及污染源样品中选取不同类型的水样，开展了发光细菌毒性测试，探讨了不同环境管理目标的样品急性毒性定量表征方式。

1 实验部分

1.1 材料

MicroTox稀释液，MicroTox渗透压调节液，MicroTox补充液，实验用小玻璃试管，费氏弧菌冻干粉(批号 12B4022、12K4130A);10 ～100 μL 可调节取样枪，100～1 000 μL可调节取样枪;苯酚标准溶液(标准号 GSB 07—1281-2000，批号102309)，七水硫酸锌(分析纯);Microtox Model 500毒性检测系统，仪器配备了30孔温控培养室，温度控制在(15±0.5)℃;恒温调节温控菌种培养槽，温度控制在(5.5±1)℃;实验样品测试井，温度控制在(15±1.0)℃。旋涡混合器、定时器。

污水处理厂进出水、垃圾填埋场周边地下观测井井水、部分工业企业生产废水、地下生活饮用水及地表水源样品。

1.2 方法

1.2.1 发光细菌复苏前准备

将冻干细菌容器小瓶从－20℃的冷冻柜中取出，轻轻叩击瓶壁使冻干菌落入瓶底，回升温度到4℃左右。在恒温调节温控(5.5±1)℃菌种培养槽的孔中放置一个测试试管，如复苏小支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox稀释液，如复苏大支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox补充液，使其恒温保持在(5.5±1)℃。

1.2.2 样品测试准备

根据待测样品数量准备实验试管，插入温控培养室试管井中，A、C、E排试管用于待测样品，A1加入1 mL MicroTox稀释液作为对照，A2～A5、C1～C5、E1～E5管中加入1 mL待测样品和0.1 mL MicroTox渗透压调节液，混匀保持在(15±1)℃。

B、D、F排实验前每支试管内加入0.1 mL复苏好的发光菌悬浮液。

1.2.3 冻干菌粉复苏

在回升温度到4℃左右的菌粉瓶中加入(5.5±1)℃的稀释液或补充液，小包装菌粉每支加入0.3～0.4 mL稀释液，用旋涡混合器振荡混匀，置于(15±1)℃试管井复苏15 min开始实验，大包装菌粉每支加入1 mL MicroTox补充液混匀制成发光细菌浓缩液，使其恒温保持在(5.5±1)℃复苏5 min，实验时取浓缩菌液，按1∶10比例用MicroTox稀释液稀释置于(15±1)℃试管井复苏15 min开始实验。

1.2.4 样品测试

Model 500毒性检测系统设置了不同的操作程序，按照仪器操作程序指示在发光菌复苏15 min后开始实验，先测试0.1 mL发光菌初始发光值，再往每支菌液试管加入0.9 mL已恒温在(15±1)℃的稀释液或调整好渗透压的样品溶液，混匀，计时，然后测试发光强度的变化。样品毒性初步筛选实验按照81.9%Screening Test模式，每个样品测试平行双样，每批次样品加空白或毒性参照物做质控样，初筛实验时发光抑制率在60%以上的高毒样品，将样品按指数梯度稀释，按照81.9%Basic Test模式进行半数效应浓度(EC50)试验。2个模式均可同时测试样品与菌种接触5 min及15 min的发光抑制情况。

2 结果与讨论

2.1 毒性测试质量控制

2.1.1 标准曲线

依据美国的标准方法要求，选择了易溶、稳定、常见、价廉、对人和环境危害小的苯酚和硫酸锌为毒性参照物，将苯酚、七水硫酸锌标准溶液按指数梯度稀释，按照81.9%Basic Test模式进行实验，对测试数据进行回归分析，建立苯酚浓度或硫酸锌浓度与发光抑制率的回归方程，求出苯酚或硫酸锌的EC50，苯酚和硫酸锌的EC50基本符合美国标准方法［11］规定:苯酚为 13～26 mg/L，硫酸锌为5～12 mg/L。苯酚曲线的相关系数(R2)为0.983 2～0.991 5，硫酸锌标准溶液曲线的相关系数(R2)为0.888 9～0.956 0。图1、图2分别为苯酚、硫酸锌的回归曲线。

图1 苯酚浓度与发光抑制率的拟合曲线

图2 七水硫酸锌浓度与发光抑制率的拟合曲线

2.1.2 方法的精密度

控制相同浓度的毒性参照物的相对标准偏差在10%以内。对同一低浓度硫酸锌溶液，5 min发光抑制率平均值与15 min发光抑制率平均值差异较大，在测试水样综合毒性尤其是可能由于重金属污染引起的毒性时，应选择15 min或更长的暴露时间。实际水样的急性毒性测试结果均按照样品与菌种接触15 min的测试结果进行统计计算。

2.1.3 空白值的质量控制

为保证测试结果有效，排除因菌液质量不稳定带来的误差，每批次样品测试时要加1～2个MicroTox稀释液作空白样或加一个毒性参照物作质控样。空白值波动曲线见图3，控制实验的空白发光抑制率在－10% ～10%之间［3］。

图3 空白样的发光抑制率波动曲线

2.2 在饮用水源监测中的应用

发光细菌急性毒性测试在饮用水源监测的应用目标是对突发污染事故进行预警，一般情况下以发光抑制率低于20%作为毒性污染的判定值，但自然水体成分复杂，可能存在适于微生物生长的元素，会出现刺激发光细菌发光的情况。在饮用水源监测中，利用大量日常测试的无毒样品的发光抑制率值为背景值，按照公式 D=μ±3SD(式中μ为监测数据的平均值，SD为标准偏差)的统计方法［4］，计算出各水源水、地下水的毒性预警基准线，能更及时准确地判断饮用水源是否受到毒性污染。图4为应用某地表水源日常监测数据绘制的毒性预警基线图，样品发光抑制率落在－24.3% ～16.5%之间为正常;图5为应用33口井水的测试值绘制的毒性预警基线图，对于地下水样品，发光抑制率落在－33.1% ～－1.9%之间为正常。日常监测的无毒性基础数据可以随时补充代入计算，数据越多，生物毒性预警的准确率越高。

图4 某地表饮用水源发光细菌急性毒性测试预警区间

图5 地下饮用水发光细菌急性毒性测试预警区间

2.3 在污染源监督监测中的应用

应用发光细菌测试了6家垃圾填埋场周边34口观测井井水的急性毒性，按照发光抑制率大于20%的毒性经验判定值来统计，有2个发光抑制率大于50%的高毒样品，有1个发光抑制率接近20%的低毒样品，结果见图6。但按照地下水的预警区间统计(图5)，发光抑制率低于20%的样品中有11个样本有轻微毒性。同时测试了6个处理后的垃圾渗沥液样本，发光抑制率均为负值，对发光细菌未产生急性毒性。测试了一个未经处理的垃圾渗沥液样本，发光抑制率为96.3%，毒性极强。

图6 2013年垃圾填埋场周边观测井井水发光细菌毒性测试结果

应用发光细菌测试了34家城市污水处理厂的处理后出水，除了1家发光抑制率为4%，其余33家均为负值;测试了5家企业处理设施出水样本17个，其中12个样本发光抑制率均为负值，表明经过生化处理的出水对微生物的急性毒性风险很低。现代废水处理工艺中都要利用驯化的微生物群落降解有机物，因此生化处理后的出水如未经加氯消毒处理，对处于同一营养层的发光细菌的发光不会产生影响。废水经净化处理，达到一定的排放标准后，仍可能含有痕量有毒有害污染物［3］，这些物质是否存在慢性毒性以及是否对其他种类生物产生毒害作用还需要进一步的实验证明，因此应选用营养级别更高的生物对生化处理后的出水开展毒性测试，以降低排水对受纳水体生物的影响，从而保证水环境的生态安全。

对21个不同类型的污染源水样进行了发光细菌毒性测试，分别为7个污水处理厂进水、1个机电企业生产废水、1个防水技术企业废水、1个化工生产废水、9个重金属相关企业废水、2个未处理的垃圾填埋场渗沥液。其中，12个样品发光抑制率大于20%，有57.1%的样品显示出对发光细菌的毒性效应，这期间9个样品发光抑制率在50%以上，毒性很强(图7)。对于这些毒性较强的样品需要进行进一步的试验确定其毒性大小。发光抑制率在60%以上的高毒样品，将样品按指数梯度稀释，按照 81.9%Basic Test模式进行EC50试验;发光抑制率在60%以下的样品将发光抑制率值代入苯酚或硫酸锌标准曲线公式，计算相当于毒性参照物的当量浓度。

图7 不同类型污染源水样发光细菌毒性测试结果

2008年起，中国对发酵类制药行业开始实施发光细菌毒性控制管理，标准限值采用氯化汞的质量浓度，排放限值为氯化汞的质量浓度(0.07 mg/L)［1］。选择1家制药企业的废水进行了发光细菌毒性测试，结果见表1。王丽莎等［2］曾经应用明亮发光杆菌比较过锌离子和氯化汞的毒性，并计算出两者之间毒性强度的关系，氯化汞的毒性是锌离子毒性的12.5倍。按照这个系数可以计算3个出水的氯化汞质量浓度分别为0.86、0.03、0.02 mg/L。由于这个系数是应用明亮发光杆菌测试得到的，这样的计算可能不一定适用于费氏弧菌实验，却有所启示:应用费氏弧菌测试氯化汞、七水硫酸锌毒性，建立起两者毒性强度之间的相关关系，就可以使用低毒的硫酸锌为参照物测试制药废水，同时避免剧毒的氯化汞危害人体健康和生态环境。

表1 制药企业出水的发光细菌毒性测试结果

2.4 发光细菌毒性定量表征

对于发光细菌急性毒性的定量表征方式，中国国标测试方法选用的是等效氯化汞或苯酚的质量浓度，国内也有科研人员采用百分数等级划分标准［12］衡量样品毒性。德国在生物毒性监测管理中，应用GL定量表征生物毒性。在发光细菌毒性测试中，将样品稀释成系列浓度并测定每个稀释浓度的发光抑制率，其中造成20%或20%以下发光抑制率的样品的稀释倍数即为GL，稀释因子直观反映了废水稀释到什么程度再排放才对水环境生物无不良影响。美国、加拿大、爱尔兰采用EC50来定量表征发光细菌毒性［1］，EC50能清楚地区分不同样品的毒性大小，但在水样毒性小于半数效应的浓度时难以确定毒性的效应水平。表2列出了不同样品应用这些不同的毒性表征方式计算所得的结果。

表2 样品发光细菌毒性不同的定量表征结果

从表2和图1可以看出，当样品发光抑制率小于60%时，用参比物(苯酚)质量浓度表示毒性直观清楚;当样品发光抑制率大于60%时，表示等效毒性参比物(苯酚)的曲线趋于平直，说明即使不断增加苯酚浓度，发光抑制率的变化也不再显著。这表明，按标准曲线计算出的苯酚质量浓度已不能准确表征各样品之间毒性的实际差异。

当样品发光抑制率大于60%时，将样品按指数梯度稀释，测试各稀释度样品的发光抑制率，绘制样品稀释度与发光抑制率的拟合曲线，依据曲线计算EC50或稀释因子，稀释因子直观反映了废水毒性消失的稀释倍数，因此，稀释因子定量表示高毒样品的毒性，直观地反映了环境样品对生物的影响，体现出在工业废水毒性管理中良好的应用价值。

3 结论

发光细菌急性毒性测试在环境应急监测、水源早期生物预警中，采用绘制毒性预警基线图的方式比较可行;在污染源监督监测中，对于发光抑制率低于60%、无法求出EC50的样品，采用等效毒性参照物的质量浓度表征废水的毒性，对于发光抑制率高于60%时，采用稀释因子表示样品的毒性更直观可靠。

城市污水处理厂的出水、经过生化处理后工业废水、渗沥液等，虽然均刺激发光细菌发光强度增加，但仅仅代表生化处理出水对发光细菌没有急性毒性。废水经净化处理后，达到一定的排放标准，仍可能含有痕量有毒有害污染物，这些物质是否存在慢性毒性以及是否对其他种类生物产生毒害作用还需要进一步的实验证明。

应用发光细菌测试垃圾填埋场观测井、渗沥液、工业企业生产废水、污水处理厂进水等样品毒性，可以避免或减少废水过高的毒性对污水处理工程菌的危害，降低处理成本。应加强对这些样品生物毒性的监督监测，建立起相应的毒性监督管理标准，从而有效地督促工业企业对废水处理工艺的改进和优化，保证工业废水安全排放，控制水环境污染，保护水资源。

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