治疗性亚低温对缺血再灌注损伤神经功能保护作用机制的研究进展

李恒 黄子通

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.030

作者单位：523900 广东省东莞，东莞市太平人民医院急诊科（李恒）；中山大学心肺脑复苏研究所（黄子通）

通信作者：李恒，Email：lh12818@163.com

治疗性亚低温（32～34 ℃）被认为是目前对全脑缺血再灌注唯一有效的治疗措施。按照循证医学理论，美国心脏病协会、欧洲复苏协会都将治疗性亚低温疗法写入心肺复苏的国际指南中。在兼顾亚低温实验研究的基础上，更强调临床的转化应用，以期挽救更多患者生命。目前，对亚低温的基础研究已经进入到一个前所未有的发展水平，逐渐由最初的现象、早期的血流动力学、细胞形态学变化，深入到分子、基因等微观水平。对亚低温的长期效果，也逐渐开始重视，因此，本文就目前亚低温对缺血后神经功能保护机制的研究现状做一综述。

1急性期效应（<24 h）

亚低温的短期保护效应是目前研究成果最丰富的内容，从血流动力学、能量代谢等方面都观察到显著的效果。

1.1 降低葡萄糖和氧代谢，保存高能磷酸化合物

Sakoh和Gjedde^[1]对正常麻醉状态下家猪采取冰冻空气降温后发现，当脑温降至32 ℃时，脑组织血流和氧消耗在第3～5小时内会降至基础状态的50%，而氧摄取率则会增加140%。此外，Laptook等^[2]通过对心搏骤停后小猪脑组织内31P和1H的核磁扫描后发现，脑温度与组织能量代谢率呈正相关（r=0.92，P<0.01），并且温度每下降1 ℃，能量代谢率会降低5.3%。在新生乳鼠缺血-缺氧性损伤的模型中也观察到类似的结论，Williams等^[3]认为脑组织磷酸化潜能与ATP水平随着温度的降低可以保存，其中31 ℃下的脑水肿程度要比34 ℃、37 ℃显著减轻。然而，动物实验条件下的某些结论尚难推及临床。例如，Gupta等^[4]对30例GCS<8分的脑损伤患者采取33 ℃亚低温治疗后发现，脑组织氧分压（PO2）随着温度降低出现下降趋势，并且在<35 ℃后下降更明显，因此他认为脑温低于35 ℃会影响脑组织的氧合程度。

1.2 改善脑组织血流灌注

亚低温对脑组织血流的影响需要视情况而定。对于正常脑组织而言，其血流量会随着温度降低而下降，Palmer等^[5]通过表面低温方法，对比新生狗重要器官（脑、心等）的血流量检测后发现，基础血流越丰富的器官，温度降低后它们的血流下降得越明显。在脑缺血损伤情况下，由于血管再灌注后病理生理条件存在，亚低温的核心作用在于抑制再灌注后的血管自主调节功能障碍，即减少快速充血以及继发的血流降低^[6]。此外，亚低温的这种血管调节功能是低温本身的直接效应，抑或是通过血管神经-体液的间接调节机制，目前尚未有定论。

1.3 延迟缺氧去极化发生

神经元缺氧去极化效应（anoxic depolarization，AD）是形态损伤出现之前的前兆性功能改变。Takeda等^[7]通过对沙鼠全脑缺血的模型发现，低温能够延迟AD的出现时间，而且温度越低，AD出现时间越延迟。在此基础上估算出，31 ℃亚低温条件下，导致50%神经元死亡的缺血时间为14.2 min，明显长于常温组。此外，Mori等^[8]对缺血后大鼠细胞外间隙、Na+、K+离子浓度分析后发现，31.5 ℃的低温会延缓K+电位爆发、Na+电位衰减的时间，从而延缓了细胞外间隙缩小（脑水肿出现）的时间。这对临床有重要的提示，即如果能够在AD出现前进行亚低温的干预，或许能避免或减轻后续神经元细胞的永久损伤，最大限度的保存神经功能。

1.4 减轻兴奋毒性氨基酸损伤

谷氨酸是中枢神经系统缺血损伤中最常见的兴奋性氨基酸。实际上，细胞外的谷氨酸浓度（[Glu]e）反映的是其在神经细胞中释放和摄取之间动态平衡的结果。缺血缺氧发生后，谷氨酸在AD发生当时即开始从细胞内释放，随着血管再灌注以及ATP的恢复，在AD得以改善的基础上，谷氨酸也会被逐渐摄取至细胞内部。研究发现，Glu的毒性作用主要是由于细胞外过多的谷氨酸激活了膜上的Ca2+通道，触发Ca2+内流引起相关损伤^[9]。通过全脑缺血动物模型，研究人员发现，亚低温可以完全或部分抑制Glu释放^[10-11]，延迟Glu释放时间^[12-13]以及增加神经细胞对Glu的摄取功能^[14-15]。Colbourne等^[16]進一步分析认为，亚低温可以促进AMPA受体亚基——谷氨酸受体2（GluR2）mRNA早期恢复表达，而该受体的缺氧性下调被认为与Ca2+内流增加有关。

1.5 调控细胞水平的应激反应

目前仅有为数不多的研究关注亚低温对细胞应激水平的影响。热休克蛋白家族（HSP）被认为可能参与了大部分低温调节细胞应激，实现保护效应的事件。Terao等^[17]对大鼠大脑中动脉结扎2 h后采取亚低温处理后发现，HSP70的水平明显增加，而且进一步分析发现，HSP70蛋白mRNA的转录过程并不受缺血事件影响。但需要注意的是，亚低温调控应激水平达到保护作用的假说是基于HSP的抗凋亡与抗炎机制的延伸，因此存在低温条件下HSP的增加可能仅为一种伴随现象，而且是否能够发挥效应并未获得严格证明。相反，有部分研究则指出，亚低温反而降低HSP的表达或对其没有影响^[18-19]。

2 亚急性期效应（<7 d）

缺血性脑损伤再灌注后1～7 d内存在第二次损伤的病理生理基础，这与血流恢复后激活再灌注相关的损伤途径，如氧自由基产生、炎症反应等有密切关系。

2.1 減少细胞凋亡

全脑缺血再灌注损伤后神经元表现为凋亡为主的细胞死亡方式。现已证明，亚低温能够作用于内、外源性的细胞凋亡通路，减少亚急性期神经元凋亡产生。

其中，BCL-2家族成员BAX是重要的促凋亡因子，它可以诱导细胞色素c释放并进一步激活caspase。亚低温可以降低BAX的表达、增加抗凋亡因子BCL-2的含量，最大限度地抑制下游凋亡级联反应的发生^[20]。此外，蛋白激酶Cδ（PKCδ）也是凋亡通路的重要蛋白，在caspase 3的作用下，PKCδ会从胞浆进入线粒体和细胞核内，启动凋亡过程。Lee等^[21]在大鼠MCAO模型中发现，在再灌注前15 min和再灌注后15 min分别诱导并维持3 h的30 ℃低温治疗，缺血核心区和半暗带中的PKCδ虽然含量变化不明显，但是其裂解出现减少，阻断了其向线粒体和胞核的转移。而且，低温可以保存PKCδ的异构体——PKCε在缺血区的水平，而这种蛋白在体外被认为具有明显的神经保护作用^[22]。

亚低温作用于外源性凋亡途径的主要方式是抑制启动初始阶段蛋白的表达、结合与激活。Liu等^[23]发现，缺血期的亚低温可以抑制FAS、MMP和caspase 8的激活，同时最大限度地保存膜结合的FASL蛋白。实际上，亚低温阻断FASL的裂解并与MMP、caspase启动的下游凋亡通路有关。另外，Xu等^[24]通过体外皮层神经元模型中找到小幅度降温作用凋亡初始阶段的另外证据，他发现JNK和细胞色素c的转移会被同时抑制，从而防止了下游caspase蛋白的激活。

2.2 增加损伤细胞存活机会

中枢神经系统损伤后，周围神经细胞会产生一类分子，以期最大限度的拯救受损细胞，这些分子包括脑源性神经生长因子（BNDF）、胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）以及神经素。它们参与神经突触的重塑、神经网络再造等过程，避免神经细胞的结构性损伤事件。Vosler等^[25]在窒息性心搏骤停的大鼠模型中发现，33 ℃的低温处理后，大鼠海马BNDF的外显子Ⅲ表达明显增加，虽然缺乏直接证据，但这提示亚低温可能会提高BDNF的转录效率。采取同样的模型，Cruz等^[26-27]发现，延迟1 h开始的亚低温会在24 h时明显增加大鼠海马区的BDNF含量，以及BDNF的受体酪氨酸磷酸化水平。除此之外，BDNF的下游分子如细胞外信号调节激酶（ERK）也同时被激活，而ERK则是参与细胞生长、增殖的重要启动因子。GDNF能够抑制caspase等促凋亡蛋白形成，刺激神经祖细胞产生。Schmidt等^[28]研究发现，亚低温对大鼠中枢神经不同结构内GDNF会产生不同的影响。其中海马的GDNF在6 h内升高，12 h内降低，而小脑、脑干的GDNF则在24 h内均无明显变化。这说明不同部位的细胞存在修复不同步现象，亚低温对缺血损伤敏感区的保护效应发挥得较早。

2.3 调节氧自由基

缺血再灌注后，脑部会出现快速而短暂的自由基应激。在狗长时间心搏骤停模型中发现，再灌注后大脑皮质的脂质过氧化水平进行性增加，并且伴随有大量脂质还原型双键的丢失。而且，这种氧化应激损伤会持续16～24 h^[29]。进一步地，Katz等^[30]在窒息性心搏骤停大鼠模型中对比了短时程（4 h）、长时程（24 h）体表低温及药物调节性低温（神经紧张素类似物NT77诱导）对脑部氧化应激效应的影响后发现，调节性亚低温方法与长时程体表低温都能够降低复苏后48～72 h大鼠海马丙二醛水平，而短时程低温则达不到这个效果。Mueller-Burke等^[31]通过窒息性心搏骤停的新生家猪模型模拟了缺血缺氧性脑损伤过程，他们发现复苏后的亚低温可以抑制纹状体内NMDA受体的激活与神经元一氧化氮合成酶激活，以及后期蛋白质的氧化过程，而这三者被认为与纹状体细胞的凋亡密切相关。在创伤性脑损伤模型中，Kuo等^[32]通过颈外静脉逆行灌注冰冻生理盐水后发现，脑部降温组的氧化应激（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶降低，丙二醛增高）、硝基化应激损伤（神经源性一氧化氮合成酶、3-硝基酪氨酸增高）较常温组显著降低，伴随而来的神经保护效应则是大鼠运动功能获得明显改善。而最近一项对心肺复苏后家猪的研究后认为，复苏后维持12 h的亚低温可能是通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ降解以及上调超氧化物歧化酶MnSOD水平来达到神经保护效应^[33]。

2.4 调控炎症介质

炎症学说在复苏后神经功能损伤中占有重要的地位。根据目前的证据分析，全脑缺血后的炎症反应主要来自于局部小胶质细胞的激活，部分来自于血管壁聚集的白细胞释放的细胞因子作用^[34-35]。在体外培养的小胶质细胞模型中发现，低温处理后的细胞释放IL-6，IL10及NO水平较常温及高温组均显著降低^[36]。Webster等^[37]通过双侧颈动脉结扎模拟的大鼠全脑缺血模型中发现，亚低温处理在抑制海马区小胶质细胞激活基础上，进一步降低NF-κB的易位和激活。以高迁移率族蛋白B（HMGB1）作为早期炎症指标，Koda等^[38]研究认为，采取再灌注后亚低温治疗，可以明显降低这种炎症因子的表达，获得与缺氧前亚低温预处理类似的治疗效果。此外，在家猪心肺复苏模型中也观察到，单纯亚低温或亚低温联合麻醉剂（七氟醚）均可以降低复苏后24 h家猪脑皮质的细胞因子IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α，ICAM-1水平^[39]。

2.5 调节血脑屏障作用

缺血再灌注后血脑屏障（BBB）的破坏构成后期脑水肿、脑出血的病理学基础。亚低温可以从组成BBB各个结构来维持其相对正常的生理功能。研究发现，脑缺血后即开始的6 h亚低温治疗，可以减少血管基底膜蛋白，聚集蛋白和骨黏连蛋白的丢失，稳定血管基底膜结构^[40]。进一步发现，亚低温对结构细胞的效应并不仅限于此，借助于亚低温作用，周细胞等才能够继续依附于血管壁，维持BBB的正常结构。从BBB相关蛋白角度分析发现，亚低温可以直接调节基质金属蛋白酶（MMPs）和水通道蛋白4（Aqp4）等水平，在防止细胞外基质降解，减轻脑水肿等方面，发挥重要的神经保护效应^[41-43]。此外还发现，亚低温能够影响BBB上多重耐药蛋白1（MDR1）的表达，这可能会为亚低温期进一步联合药物治疗保护神经功能提供研究契机^[44]。

3 远期效应（≥7 d）

亚低温治疗的最终目的在于最大限度的減轻神经损伤，尤其是挽救高级神经功能。除了上述对缺血再灌注后短期的影响外，早期介入的亚低温对长期神经功能恢复也表现出促进作用。

3.1 对神经元再生影响

研究已经发现，哺乳动物的中枢神经再生能力随着年龄增长出现减退趋势。对发育中的脑组织神经干细胞而言，不同的温度和维持时间可能带来截然不同的神经再生趋势。Xiong等^[45]在对出生7 d的乳鼠采取结扎单侧颈动脉模拟新生儿缺血缺氧性脑病的模型中发现，采用32～33 ℃温度维持24 h，虽然神经干细胞（BrdU，Nestin双标阳性）数量上与常温组（36～37 ℃）差异无统计学意义，但是未成熟（BrdU，Tuj-1双标阳性）与成熟（BrdU，MAP-2双标阳性）神经元数量均显著高于常温缺血组。这提示在神经干细胞增殖能力相当的情况下，24 h的亚低温处理更倾向诱导其向神经元方向分化。Saito等^[46]对体外培养的神经干细胞使用32 ℃处理后发现，这些神经干细胞的“干性”亦较常温组得以保存。

然而也有不少研究者对低温诱导神经元、突触再生能力持怀疑态度。采用颈部动脉夹闭的动物模型，Takeshi^[47]发现30 ℃维持21 h后，乳鼠海马齿状回颗粒下层BrdU标记的新生细胞数量较常温组不但没有增加，反而明显降低了。Silasi等^[48]发现，全脑缺血后低温治疗除了最大限度的保存了新生颗粒细胞的活性外，并不能增加海马CA1区神经元再生。此外，他还发现脑缺血后不同时程的亚低温（2，4，7 d）对中枢神经元再生、突触形成以及脑源性神经生长因子（BDNF）的合成并无显著影响^[49]。Lasarzik等^[50]比较了常温和低温对颈动脉夹闭后大鼠脑组织内神经细胞再生能力的影响后发现，脑缺血后第28天的神经元再生能力并未从围缺血期的亚低温处理中获益。因此从目前的研究证据上看，亚低温对神经再生的影响可能存在某一段时间限制的作用时间窗。未在时间窗内干预或者超时程干预，都可能会影响亚低温诱导神经再生的效果。

3.2 促进神经元突触连接形成

显而易见，缺血后脑功能恢复不仅需要神经元再生，而且这些新生神经元必须能够重新建立突触连接，为神经冲动形成基本的传导环路。对麻醉状态下的正常大鼠研究发现，32 ℃亚低温处理90 min后，海马CA1区长时程增强的群峰电位幅度会较常温组增加68.4%，而且复温后仍能维持在131.9%水平，这提示低温能够增加海马的突触传递效应^[51]。最近一项研究采取全基因芯片分析方法发现，MCAO大鼠经过4 h的亚低温处理，脑内N-钙黏连蛋白（CDH2）基因表达显著增加，而上调CDH则被认为是修复神经突触的可能机制之一^[52]。

3.3 胶质细胞再生和新生血管形成的影响

目前极少有研究关注低温对缺血后脑组织内胶质细胞再生的影响及其在脑功能恢复中的角色。胶质细胞再生在不同的模型、不同温度及实验条件下，会有截然不同的结果。以少突胶质细胞为例，30 ℃低温会抑制祖细胞的增殖，而33 ℃的低温则得出相反的结论[48，53]。除此之外，低温对缺血损伤后期星形胶质细胞的影响也不明确。从现象上看，亚低温在一定程度上会增强中风、创伤性脑损伤模型中的中枢新生血管形成效应^[54-55]，但按照目前证据，尚无法确定新生血管形成事件与神经功能恢复之间的关系。

4 结语

治疗性亚低温对缺血后脑损伤急性期保护作用早已明确，但对亚急性期，尤其是远期的保护效应机制，依然期待更深入的研究。从基础研究的角度分析，我们尚需要更多证据阐明亚低温对细胞死亡相关的信号传导方式的影响。

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