正畸力作用下鼠压力侧牙周组织中ATF4和RUNX2表达及意义

韩金友　张彬　陈保兴　杭望雁

【摘要】 目的：探讨ATF4和RUNX在鼠正畸牙移动过程中的表达变化及其作用。方法：将大鼠按正畸力作用时间分为0、3、6、12、24 h及3、5、7、14 d组，以右侧上颌第一磨牙为实验侧，给予持续正畸力；左侧第一磨牙为对照侧不加力。采用RT-PCR、Western blot法和免疫组织化学法检测ATF4及RUNX2 mRNA和蛋白的表达，HE染色观察其细胞形态。结果：对照侧牙周组织内ATF4和RUNX2 mRNA水平有表达，其蛋白几乎没有表达。实验侧加力后蛋白表达增强并与牙齿移动时间相关。压力区组织在12 h时ATF4和RUNX2表达量最高，24 h后组织中ATF4和RUNX2表达值开始下降；且实验侧ATF4和RUNX2表达量与对照侧比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：压力可以诱导牙周组织中ATF4和RUNX2 mRNA和蛋白的短暂升高，两者在正畸牙移动过程中的牙周组织改建和成骨过程中发挥作用。

【关键词】 ATF4； RUNX2； 正畸牙移动； 牙周组织； 大鼠

转录活化因子4（activation transcription factor，ATF4）是新近发现的具有调节成骨细胞分化功能的转录因子，而RUNX2（runt-related transcription factor-2），是一个多功能转录因子，是第一个被证实的成骨细胞特异性转录因子[1-2]。这些转录因子诱导特异的细胞信号转导途径，对正畸力做出反应，并引发一系列细胞生物学反应。其主要是通过调节与骨形成相关的细胞分化和细胞外基质蛋白的表达变化完成对骨骼发育的调控作用[3-4]。而转录因子与正畸牙周组织改建过程中机械信号传导方面的研究鲜有报道[5-6]。本文用RT-PCR、免疫组织化学法和Western blot法分析了正畸力作用下RUNX2、ATF4H和蛋白在鼠压力侧牙周组织中的表达情况，探讨了RUNX2和ATF4在正畸牙周组织改建中的作用、相互关系和相互调控。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠72只，体质量（220±10）g（山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20130001）。根据正畸力作用时间分为0、3、6、12、24 h及3、5、7、14 d组，右侧上颌第一磨牙为实验侧，给予持续正畸力；另一侧第一磨牙为对照侧，不加力。适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 主要试剂 RNA提取液Tizol试剂（Sigma公司，美国），逆转录聚合酶链反应（Semi-quantitative RT-PCR）试剂盒和免疫组织化学检测试剂（济南翔科生物科技有限公司），兔抗大鼠ATF4多克隆抗体（北京博奥森生物试剂公司），RUNX2抗体（Bioworld Technology公司，美国），SABC免疫组化试剂盒和DAB显色盒（北京百浩生物科技有限公司），引物β-action由上海生工生物有限公司设计并合成。日本Olympus公司AUS 5400全自动生化分析仪，德国Heraeus高速冷冻离心机，上海富士胶片有限公司LAS-4000凝胶成像仪。

1.2 实验方法

1.2.1 牙移植模型的建立 所有实验动物均定时、定量摄食，自由饮水。实验动物上颌左侧戴矫治器进行加力作为实验侧，上颌右侧未戴矫治器作为对照侧。喂养1周后，用10%水合氯醛经腹腔注射（3 mL/kg）麻醉大鼠，然后用精细牙科高速车针在实验动物左侧上颌第一磨牙和双侧上颌切牙颈部磨沟深约0.5～1 mm然后将双侧上颌切牙连扎并在其与第一磨牙间放置镍钛螺簧以双侧上颌切牙为支抗，牵引左侧上颌第一磨牙向近中移动力值为39 g，分别在戴矫治器后0、3、6、12、24 h和3、5、7、14 d用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉并处死。

1.2.2 牙周组织标本的制备 实验完成处死动物后，取牙周膜新鲜组织块，分出一部分组织进行RT-PCR和Western blot，其余组织用多聚甲醛进行固定，固定24 h，然后在4 oC下，进行脱钙处理，并依次脱水和制备组织包埋切片。石蜡切片制备好后，用于后续实验的病理学HE染色和免疫组织化学染色。

1.2.3 RT-PCR检测ATF4和RUNX2 mRNA的表达 Trizol对细胞进行裂解并提取总RNA，采用Toyobo RT-PCR试剂盒进行一步扩增。并用beta-actin作为实验内参对照。ATF4上游引物和下游引物分别为5-CCCTCCACCTTCTTACAACC-3和5-TACGACTCTGGGCTCATAC-3。扩增产物片段为218 bp。RUNX2上游引物和下游引物分别为5-AGTGTGTGTGTCCGCATGAT-3和5-CCACTTGGGGTCTAAGAACG-3。扩增产物片段为232 bp。内参beta-actin上游引物和下游引物分别为5-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3和5-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3。扩增产物片段大小为311 bp。上述引物有上海生工生物有限公司合成，PCR产物经2%琼脂糖电泳后用凝胶成像系统成像并拍照。

1.2.4 Western blot检测ATF4和RUNX2蛋白表达变化 组织细胞破裂后，进行核蛋白抽提，首先用PBS洗细胞，弃去清液后加入细胞裂解液，离心去除胞质蛋白。核沉淀加入核蛋白裂解液，裂解充分后，高速离心4 ℃，12 000 g离心5 min，取上清分装，为胞核蛋白，-80 ℃保存备用。蛋白定量后，于100 ℃水浴5 min使蛋白变性，进行8% SDS-PAGE电泳。电泳后蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相关蛋白一抗，于4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗涤膜3次，后加入相关蛋白二抗，于37 ℃孵育45 min，TBST洗涤3次后，在暗室中压片、显影、定影。图像应用Alpha Imager 2200软件进行分析。endprint

1.2.5 免疫组织化学染色 于transwell板上室加入Matrigel胶（Becton Dickinson Company）与无血清培养基混合液，37 ℃，30 min，使Matrigel聚合成胶。无血清培养基培养A2780及LEC1细胞过夜，次日消化细胞，无血清培养基重悬细胞。每个transwell板上室加入100 μL细胞悬液（5×105个细胞），分别加入金雀异黄素联合阿霉素药物，终浓度为1、2、4 μg/mL，下室加入500 μL NIH3T3细胞无血清培养上清。培养72 h后，湿棉签轻轻拭去聚碳酯膜和Matrigel凝胶表面的细胞。小心取出上室，甲醇固定30 min。苏木素染色，脱水，切取碳酯膜于载玻片上中性树脂封片，400倍高倍镜下计数，取平均数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验及单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR结果显示不同加压时间点ATF4和RUNX2的mRNA表达变化 实验侧牙周膜组织中ATF4和RUNX2 mRNA水平有表达，加压不同时间后，两者的mRNA水平发生变化。在加压后24 h达到表达最高值，其后表达下降，加力3 d后降至加力前水平。不同加压时间点ATF4和RUNX2的mRNA表达变化见图1。

2.2 Western blot检测不同加压时间点ATF4和RUNX2蛋白水平的表达变化 对照侧牙周膜组织ATF4几乎不表达，RUNX2表达水平很弱，加压后的实验侧中蛋白水平开始升高，在24 h达到最高值，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1～2；加力24 h后，继续增加作用时间，蛋白水平表达下降，加压至14 d后，蛋白基本降至加压前的水平。不同加压时间点ATF4和RUNX2蛋白水平的表达变化见图2。

图1 不同加力时间点下ATF4和RUNX2的mRNA水平变化

注：1～9分别代表0、3、6、12、24 h和3、5、7、14 d组

图2 不同加力时间点下ATF4和RUNX2蛋白表达变化

2.3 HE染色结果 光镜下可见对照侧牙周膜组织间隙均匀，其组织周围纤维排列整齐，主纤维内均匀分布着成纤维细胞。实验侧在加力3 h后即可见侧牙周膜的间隙变窄小。加压6、12 h和1 d后，侧牙周膜组织间隙进一步变窄小，并伴随成骨吸收陷窝的形成。在3、5、7 d后，牙槽骨表面继续吸收陷窝并形成多个破骨细胞，发挥明显的骨吸收作用；加压14 d后，两侧侧牙周膜组织宽度保持一致，并在牙周纤维处伴随新牙骨的形成（图3）。

2.4 免疫组织化学检测结果 免疫组织化学显示ATF4和RUNX2主要分布于细胞核，阳性细胞有棕黄色颗粒形成。在整个实验过程中，不同加压的实验侧牙周组织及其对照侧中ATF4和RUNX2的表达变化如图4所示。在正常对照组中，ATF4和RUNX2两者呈弱阳性，免疫组织化学检测其主要分布于牙周膜和牙龈成纤维细胞、成骨细胞及骨细胞胞浆中。加压1 d后，阳性细胞个数最多，染色最强。其后，实验侧牙周膜ATF4和RUNX2阳性着色随加力时间的延长而逐渐减弱，加力14 d时，ATF4和RUNX2的表达已明显的减弱，但仍稍高于对照侧。ATF4和RUNX2免疫组织化学检测结果见图4。

3 讨论

正畸过程中牙齿移动的基础是机械力导致压力侧牙槽骨吸收，张力侧牙槽骨形成。机械力刺激既可以诱导细胞外基质变化，又可以产生一系列生物学反应，继而诱导牙周组织的改建和重组[7-10]。牙周膜内存在多种细胞，这些细胞在特定的机械信号传导途径下才具有向牙骨质细胞和成骨细胞分化的可能。对牙周组织实施正畸压力，诱导牙周膜细胞分化为成骨细胞，继而参与骨吸收和骨形成，是正畸牙周组织骨改建的关键[11-12]。近十年的研究显示，体外培养模拟正畸机械力刺激可诱导牙周膜细胞向成骨样细胞分化，但如何把组织改建与机械信号转化结合起来研究并应用于临床是一个复杂的系统工程，涉及到诸多的细胞因子、细胞外基质蛋白以及信号通道[13-17]。

近年来，一些学者通过体外培养的方法发现骨形成转录因子RUNX2在间充质干细胞向成骨细胞分化过程中发挥重要的调控作用[18]。Baumert等[19]发现在体外施加压力的情况下，与成骨细胞分化和骨形成过程密切相关的转录因子表达上调，证明这些差异表达的基因在成骨细胞终末分化成熟过程中起到关键的调控租用。正畸过程中，牙周组织受到外界机械力作用，将外界的力学信号转化为生物信号，涉及诸多的生物学过程。一些研究认为离子通路在这个过程中发挥作用，介导肌动蛋白的聚合并对力做出生物学反应[20]。另外的研究认为，细胞因子如前列腺素和白介素-1可以参与这个力学信号的传导，进而与细胞内外的各种蛋白和因子相互作用，形成更为复杂的网络通路，将外界力学信号转变为生物学的组织重建过程[21-22]。

本文通过构建相关的动物病理模型， 模拟临床上患者的治疗过程，验证正畸力作用下大鼠的压力侧牙周组织中RUNX2和ATF4的表达水平的变化，并对两者在表达水平上做定量分析，探讨RUNX2和ATF4在鼠正畸牙移动过程中压力侧牙周组织中两者的相互调控和互作关系。ATF4和RUNX在mRNA水平和蛋白水平的表达，实验结果显示在加力早期阶段，牙周膜内RUNX2和ATF4的表达随时间逐渐增强。随着时间的推移，牙周膜组织在外界加压下，RUNX2和ATF4的蛋白表达降低，可能原因有：（1）首先RUNX2和ATF4两者属于同一个类型的蛋白功能单元，两者具有相似的生物学功能，在生物学的发生过程中伴随着两者的协同作用，这种协同和互作的作用方式具有数个数量级的生物学效应，在牙周组织的形成过程中发挥作用；（2）两者在转录完成后，MAPK信号通路在机械力诱导的作用下使RUNX2发生磷酸化，RUNX2磷酸化后被激活并进入细胞核内，调节下游作用原件并参与转录调控作用。另外，相关研究也证明RUNX2和OPG共同作用，对骨吸收具有抑制作用，并参与和调控骨形成与骨吸收的生物学过程。但其具体的发生机制尚未阐明，还需进一步相关的研究。endprint

综上所述，在正畸牙移动过程中，笔者推测牙周组织的反应是通过正畸力经牙齿传递发生的。RUNX2和ATF4蛋白的表达变化引发牙周组织的重建，使牙齿的位置发生位移。本文的研究表明RUNX2和ATF4在牙周组织重建过程中起着重要的调控作用，是参与正畸牙移动和成骨关键通路，但其具体的作用机制有待进一步的研究和确认。

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（收稿日期：2014-05-04） （本文编辑：蔡元元）endprint

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