硫酸粘菌素诱导PC12细胞损伤模型的建立

刘 洋 李继昌

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

多粘菌素在1947年发现于多粘芽孢杆菌多个亚种的培养液中，它能有效治疗革兰氏阴性菌的感染，特别是对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌有特效（Fagalas和 Kasiakou，2006）。 此外，多粘菌素还具有抗内毒素作用，作为饲料添加剂还可促进动物生长（陈杖榴等，2002）。20世纪80年代不断有报道指出多粘菌素存在肾毒性和神经毒性，在随后的20年里，多粘菌素除用于多重耐药革兰氏阴性菌感染的纤维囊性肺炎的治疗外，其使用逐渐被新的抗生素所替代。近10年内，多重耐药革兰氏阴性细菌的产生以及有效的抗生素的缺乏使得多粘菌素再次进入人们的视野，其临床应用价值得到重新认识和再评价。然而，其神经毒性仍然是亟待解决的问题（代重山等，2012）。因此，本研究通过采用PC12细胞系建立硫酸粘菌素诱导神经毒性体外模型，为进一步筛选具有对抗硫酸粘菌素神经毒性的药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 药品与仪器 大鼠肾上腺嗜铬骨髓瘤（PC12）细胞 （来自中国科学院上海细胞库）；DMEM 干粉培养基 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Hyclone）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，Sigma）、硫酸粘菌素（Sigma）；细胞培养瓶（corning）、96 孔板（Corning）、冻存管（Corning）、二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）、FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、iMarkTM型酶标检测仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 细胞培养 PC12细胞培养于含体积分数为10%FBS的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养，每1～2 d换液1次，细胞生长至70%～80%融合时，1∶2～1∶3分瓶传代。选取对数生长期细胞进行试验处理。

1.3 绘制不同细胞密度的生长曲线 取对数生长期的细胞，用含10%FBS的DMEM培养基分别稀释至 1×104、5×104、1×105、5×105个/mL 和 1×106个/mL，每孔 100 μL接种于 96孔板中，每个浓度组设6个重复孔，并设加培养液的空白对照组。共接5块板，置于37℃的CO2培养箱内培养，分别于 4、8、12、24、36 h 用 MTT 比色法测定吸光度值 （A值）。以培养时间为横坐标，A值为纵坐标，绘制不同浓度PC12细胞生长曲线。

1.4 MTT比色法检测细胞活性 将对数生长期的细胞吹打成单个悬浮细胞后，用血球计数板进行细胞计数，用完全培养基稀释至适当细胞浓度后加入96孔板，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养相应时间后，吸去培养液，每孔加入1 mg/mL MTT 溶液 100 μL。 置于 37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4h。弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使蓝色结晶充分溶解，上酶标仪检测每孔吸光度值（490 nm）。细胞存活率以与对照组相比的百分数表示。

细胞存活率/%=（试验组吸光度-空白对照组吸光度）/（正常对照组吸光度-空白对照组吸光度）×100。

1.5 硫酸粘菌素造模浓度及作用时间的筛选试验分为正常对照组和不同浓度硫酸粘菌素组（62.5、125、250、500、1000 μg/mL），同时每组均设含培养液的空白对照组。将对数生长期的细胞用含10%FBS的DMEM培养液调整为1×105个/mL浓度后接种于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24 h后，吸弃培养基，用无菌PBS清洗3次，分别加入100 μL浓度分别为 62.5、125、250、500、1000 μg/mL 用 DMEM培养液配制的硫酸粘菌素，以无血清DMEM培养液做空白对照，置于37℃、5%CO2培养箱中分别作用 2、4、8、12、24、48 h 后， 采用 MTT 比色法测定各组A值，计算细胞存活率。

1.6 数据处理 试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS11.5进行数据分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同接种细胞密度的生长曲线 由图1可见，PC12细胞的生长速度随着接种细胞密度的增加而提高。0～8 h各浓度细胞均处于潜伏期，细胞密度为1×105个/mL时，12～36 h处于对数生长期，这期间有利于评价药物对PC12细胞的促生长作用。而细胞密度为1×106个/mL和5×105个/mL时，细胞增殖过快，24 h后进入平台期，对细胞增长造成抑制作用，细胞密度为5×105和1×105个/mL时，细胞增殖缓慢，24 h后进入对数生长期。因此，选择1×105个/mL的细胞浓度培养24 h后进行后续试验，此时细胞具有较强的增殖活性。

图1 不同接种细胞密度的生长曲线

2.2 不同浓度硫酸粘菌素对PC12细胞活力的影响 由表1可见，硫酸粘菌素为62.5 μg/mL时，在2～12 h表现出一定的促进细胞生长的作用，在12～24 h时表现出一定的细胞损伤作用。而125、250、500 μg/mL 的硫酸粘菌素作用的 PC12细胞存活率均降低，且随着硫酸粘菌素浓度的增加，细胞的存活率逐渐下降。随着硫酸粘菌素作用时间的延长，细胞存活率也显著降低。当硫酸粘菌素浓度增加到125 μg/mL，作用时间为24 h时，硫酸粘菌素开始呈现明显的细胞损伤作用，细胞活力较正常对照组差异极显著（P＜0.001）。因此试验选择125 μg/mL硫酸粘菌素孵育PC12细胞24 h建立硫酸粘菌素体外损伤模型。

表1 不同浓度硫酸粘菌素对PC12细胞活力的影响%

3 讨论

神经细胞的体外培养是一种应用广泛的实验技术，体外细胞培养所需样品量少，研究周期较短，试验条件可严格控制，既可直接观察细胞形态、生物化学改变以及药物的保护作用，又可避免在体试验诸多复杂因素的影响，所以是生理、药理、病理等研究领域的重要方法之一（张广云等，2012）。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质瘤细胞克隆化的细胞株，具有典型的神经内分泌细胞特征。PC12细胞在培养过程中性状稳定、均一，具有高度分化潜能，因而成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，广泛用于神经细胞分化，离子通道、受体和递质释放的试验材料，也是研究神经毒性的最主要的细胞株之一（王新钊等，2006）。

MTT比色微量分析是一种检测细胞生长和存活的灵敏方法，重复性好。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将外源性的黄色的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死亡细胞则无此功能（陶移文等，2003）。这些蓝紫色的结晶可被二甲基亚砜溶解，通过测定其吸光度值既可反映细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性，又能反映细胞的生长活性。MTT法与当前比较流行的细胞计数方法，如染料排斥法、计数法、克隆形成法和同位素掺入法相比，其优点是可以在酶标仪上快速分析和短期内检测大量样品，灵敏度高、准确性好；与同流式细胞计数仪计数相比，成本更小，对活细胞的检出率更高（文琛，2007）。

本试验将不同剂量的硫酸粘菌素作用于PC12细胞不同时间，以期筛选出最佳造模药物浓度和造模时间，试验结果显示除62.5 μg/mL的硫酸粘菌素在作用PC12细胞最初的12 h，表现出了一定的促生长作用，其他浓度的硫酸粘菌素对PC12细胞均有不同程度的损伤作用，细胞活力和存活率明显下降，并呈现剂量依赖性，且随着硫酸粘菌素作用时间的延长，细胞存活率显著降低。本试验以125 μg/mL硫酸粘菌素作用PC12细胞24 h作为体外模型损伤剂量和时间，更为真实客观地反映机体生理现状。而且这种细胞毒性既不像62.5 μg/mL那样，由于浓度过低对PC12细胞损伤不足，不利于试验观察；也不像250 μg/mL和500 μg/mL那样剧烈，造成细胞的过度损伤，不利于后续试验的进行。因此，125 μg/mL作用PC12细胞24 h是筛选对抗硫酸粘菌素药物细胞模型的最佳药物浓度和作用时间。

综上所述，利用本试验方法建立的细胞筛选模型具有成本低、效率高、周期短的特点，并且可重复性好，操作性强，模型稳定，故可以用作筛选对抗硫酸粘菌素神经保护剂的体外模型。

[1]陈杖榴，朱蓓蕾，佟恒敏，等.兽药药理学[M].北京：中国农业出版社，2002.225～226.

[2]代重山，李继昌，李健，等.硫酸粘菌素毒性及其残留检测研究进展[J].中国兽药杂志，2013，47（2）：56 ～ 60.

[3]代重山，李继昌，李健，等.黏杆菌素神经毒性的研究进展[J].中国兽医杂志，2012，48（9）：51 ～ 53.

[4]陶移文，刘建文，魏东芝，等.胡黄连苷-II在体外对PC12神经细胞损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2003，8（1）：27 ～ 30.

[5]文琛.MTT法测定孔雀石绿对三种鱼细胞毒性的研究：[硕士学位论文][D].武汉：华中科技大学，2007.

[6]王新钊，谭庆荣，王传越，等.奥氮平对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的保护作用[J].神经解剖学杂志，2006，22（2）：187 ～ 191.

[7]张广云，胡晓，袁平，等.谷氨酸诱导新生小鼠皮层神经细胞损伤体外模型的建立[J].神经解剖学杂志，2012，28（4）：363 ～ 367.

[8]Falagas M E，Kasiakou S K.Toxicity of polymyxins：a systematic review of the evidence from old and recent studies[J].Crit Care，2006，10：27.■