五味子乙素对人肝细胞氧化损伤的保护作用

蔡 晶，张 庆，肖 峰，迟德彪南方医科大学南方医院;中山大学第三附属医院，广州5060;南方医科大学药学院，广州 5055

五味子又名玄及、会及、五梅子，为木兰科植物五味子的成熟果实。其果实有益气生津，敛肺滋肾、止泻涩精、安神等作用，可治久咳虚喘，津少口干，遗精久泻，健忘失眠等症［1，2］。五味子乙素是五味子干燥成熟果实经有机溶剂脱脂后提取分离而得的一种药理活性物，具有显著的抗氧化作用［3，4］。自由基的产生是氧化剂发挥氧化作用的主要机制。对自由基的相关研究发现，自由基蓄积的直接后果是诱发多种疾病，如肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、癌症、心血管疾病等［5，6］，因此，人们越来越关注各种自由基对机体造成的氧化损伤。本研究采用了常见氧化剂H2O2对肝细胞造成损伤，并以Sch B保护作为研究内容，来考察Sch B对氧化损伤肝细胞的作用及可能的相关机制。

1 试剂与细胞

1.1 试剂

Sch B，购自中国药品生物制品检定所。DMEM培养基，Gibco公司;胎牛血清，杭州市四季青生物工程材料有限公司，特级;Hepes:25 g/瓶，纯度99%，FARCO化学品供应公司，进口分装，香港;CCK-8，日本同仁化学研究所(Dojindo);胰蛋白酶(美国Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司;人乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒、人天门冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒、人丙二醛(MDA)ELISA试剂盒及人超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒，以上试剂均购自研域(上海)化学试剂有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞

L02，人肝细胞株，购自上海细胞所。

2 实验方法

2.1 H2O2诱导肝细胞损伤的作用模型的建立

参照文献方法［7］，取对数生长期人肝 L02细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，调整细胞密度为5×105/mL，将细胞悬液加入96孔和6孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞全部贴壁，供实验用。

2.2 实验分组与各项指标测定

设正常对照组、H2O2模型组(H2O2终浓度为0.4 mmol/L)、五味子乙素高、中、低三个浓度组，每组设6个复孔。高、中、低浓度组分别加入H2O2(终浓度为0.4 mmol/L)和相应浓度的Sch B(终浓度分别为 15、10、5 μmol/L)，共同培养 6 h 后，收集培养上清，按照试剂盒说明检测LDH、AST、MDA的水平及SOD活力，同时用CCK-8测定细胞的存活率。

2.3 数据统计方法

3 实验结果

3.1 Sch B对H2O2损伤肝细胞存活率的影响

加入H2O2后，在显微镜下观察可见细胞减少、皱缩、细胞膜破损、结构不清、贴壁不牢和脱落等现象。CCK-8检测中，肝细胞存活率与OD值成正比。与正常对照组相比，H2O2模型组OD值有显著性差异(P＜0.01)，可使细胞存活率下降到正常组的56.8%，此结果说明0.4 mmol/L的过氧化氢对肝细胞有明显的氧化损伤作用，这与Zhu B等报道结果接近［7］。与H2O2模型组比较，Sch B各剂量组 OD值均有升高(P＜0.01)，提示肝细胞存活率提高。这表明，Sch B对肝细胞的过氧化氢损伤具有一定的保护作用，且保护作用随着Sch B的浓度增高而增强(表1)。

表1 Sch B对H2O2损伤细胞存活率的影响(n=6，±s)Table 1 Protective effect of Sch B on H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表1 Sch B对H2O2损伤细胞存活率的影响(n=6，±s)Table 1 Protective effect of Sch B on H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

注:与对照组相比，aP=0.000;与模型组相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

组别Group剂量Dose(μmol/L)OD值OD value存活率Survival rate(%)正常对照组normal - 1.627±0.011 -H2O2模型组model - 0.925±0.014 56.8a Sch B 低浓度 Sch B-L 5 1.064 ±0.023 65.4a，b Sch B 中浓度 Sch B-M 10 1.156 ±0.042 71.1a，b Sch B高浓度Sch B-H 15 1.198±0.015 73.6a，b

3.2 Sch B对H2O2损伤肝细胞LDH、AST和MDA的影响

与正常对照组相比，H2O2模型组培养上清液中LDH、AST和 MDA含量均明显升高(P＜0.05)。Sch B各处理组与H2O2模型组相比，LDH、AST和MDA含量均有所降低，且随着Sch B的剂量增加降低幅度越大，呈现一定的剂量依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05)。上述结果提示Sch B在体外对过氧化氢所导致的肝细胞损伤具有直接地保护作用(表2)。

表2 Sch B对H2O2损伤细胞LDH、AST和MDA的影响(n=6，±s)Table 2 Sch B reduced LDH，AST and MDA of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表2 Sch B对H2O2损伤细胞LDH、AST和MDA的影响(n=6，±s)Table 2 Sch B reduced LDH，AST and MDA of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

组别Group剂量Dose(μmol/L)LDH值LDH value(U/L)AST值AST value(U/L)MDA值MDA value(mmol/mL)正常对照组normal 14.12±0.09 51.16±0.15 2.80±0.08

注:与对照组相比，aP=0.000;与模型组相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

3.3 Sch B对H2O2损伤肝细胞SOD的影响

由表3可见，L02细胞以0.4mmol/L的H2O2处理6h，H2O2模型组培养上清液中的SOD活力显著降低(P＜0.05)。不同浓度的Sch B(5～15 μmol/L)均能显著提高过氧化氢损伤肝细胞中的SOD活性(P＜0.05)，随着Sch B的剂量增加，SOD活性也随之增加。

表3 Sch B对H2O2损伤细胞SOD的影响(n=6，±s)Table 3 Sch B increased SOD of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表3 Sch B对H2O2损伤细胞SOD的影响(n=6，±s)Table 3 Sch B increased SOD of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

注:与对照组相比，aP=0.000;与模型组相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

组别Group剂量Dose(μmol/L)SOD值SOD value(U/ml)正常对照组normal - 12.46±0.11 H2O2模型组model - 3.56±0.09a Sch B 低浓度 Sch B-L 5 4.17 ±0.08a，b Sch B 中浓度 Sch B-M 10 6.03 ±0.13a，b Sch B高浓度Sch B-H 15 7.15±0.12a，b

4 讨论

五味子乙素具有显著的抗氧化作用，对多器官均能起到保护作用［3］:Sch B可以作用于ROS通路，阻断NADPH的作用，从而降低高血糖小鼠的肾系膜细胞所受到的损伤［8］;Sch B亦可以显著降低由阿霉素所导致的小鼠血清心肌酶的改变，显著增加心肌组织中与氧自由基相关酶的活性，增强氧自由基清除系统的功能，明显降低氧自由基作用于脂质生成的脂质过氧化物MDA的含量，从而减轻氧自由基对心肌的损伤，还明显减轻阿霉素引起的心肌超微结构的改变，延长小鼠寿命，改善阿霉素急性心肌损伤大鼠的心功能，通过其抗氧化作用减轻心脏毒性的功能，起到抗衰老作用［9］。

根据Harman的自由基理论，过多的自由基会对机体的许多器官造成损伤，如肝脏、脾脏、脑等，尤其是肝脏最易遭受自由基的攻击，导致其细胞膜发生脂类过氧化作用。由于细胞膜中富含多不饱和脂肪酸，极易受自由基攻击，发生脂质过氧化反应，反应的终产物MDA可直接弥散入细胞内与各种成分相互作用。氧自由基亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化链式反应，因而使双链脂肪酸聚合生成MDA，后者进入膜磷脂的水相，和膜蛋白、膜磷脂上的NH2交联形成Schiff碱，Schiff碱会使细胞膜变硬，膜流动性降低，通透性增加，进而导致膜的功能损伤或丧失、肝细胞释放大量LDH、AST等。因此，MDA的高低可以间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。

在正常生理状态下，生物体内存在着一定数量的自由基，适量自由基对细胞的分裂、生长、消炎、解毒等起积极作用;机体自身的抗氧化酶系SOD、GSH-Px以及CAT等能及时地清除多余的自由基，维持体内自由基的动态平衡。SOD是体内清除自由基、抑制自由基反应的酶系之一，它能催化自由基的歧化反应、抑制黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶、清除超氧阴离子自由基等，阻止自由基与膜脂质和膜蛋白的反应，从而保护细胞免受损伤。SOD活力的高低间接反映了自由基被清除的程度和脂质过氧化的降低程度。

H2O2是一种常用的氧化剂，细胞在接触H2O2后会产生了大量的自由基，进而打破自身的氧化-抗氧化的平衡，最终引起一系列病理过程。本研究采用H2O2制作体外诱导肝细胞氧化损伤模型，选择培养上清液中LDH、AST活性、肝细胞MDA含量和SOD活力作为判断肝细胞损伤和Sch B保护作用的检测指标。本研究中L02细胞在受到H2O2处理后MDA含量反应性增高，表明自由基引起机体内生物膜上不饱和脂类的快速氧化。

实验结果表明，不同浓度的Sch B不仅可以使H2O2导致的LDH水平、AST水平和MDA含量升高呈剂量依赖性降低，而且可使SOD活力有所恢复，可明显改善肝细胞的损伤，并且对H2O2导致的肝细胞增殖率降低有恢复作用。从实验结果可知，Sch B各剂量组中MDA的含量均低于模型对照组(P＜0.01)，说明Sch B可以显著降低过氧化氢引起的MDA异常增高，这表明Sch B对自由基引起的生物膜脂质过氧化反应有抑制作用;实验亦表明Sch B处理组L02细胞的抗氧化酶活力有所增强，可能是H2O2产生的过多自由基引发。这些结果都可能与Sch B的抗氧化作用相关，但Sch B在体内是否有类似的药理学效应仍需进一步研究。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，11.

2 Li XG(李晓光)，Gao Q(高勤)，Weng W(翁文)，et al.五味子有效部位及其药理作用研究进展.J Chin Med Mater(中药材)，2005，28:156-159.

3 Chiu PY，Ko KM.Time dependent enhancement in mitochondrial glutathione status and ATP generation capacity by schisandrin B teatment decrease the susceptibility of rat heart to ischemia-reperfusion injury.Bio Factors，2003，19(1-2):43-51.

4 Chiu PY，Leung HY，Poon MK，et al．Chronic schisandrin B treatment improves mitochondrial antioxidant status and tissue heat shock protein production in vsriou8 tissues of young adult and middle-aged rats.Biogerontology，2006，7:199-210.

5 Cozzi R，Ricordy R，Aglitti T，et al.Ascorbic acid and B-carotene as modulators of oxidative damage.Carcinogenesis，1997，18:223-228.

6 Ji XY，Tan BK，Zhu YC，et al.Comparison of cardioprotective effects using ramipril and DanShen for the treatment of acute myocardial infarction in rats.Life Sci，2003，73:1413-1426.

7 Zhu B，Liu GT.Cytotoxic effect of hydrogen peroxide on primary cultured rat hepatocytes and its mechanisms.Chin J Pharm Toxicol，1996，10:260-266.

8 Jeong SI，Kim SJ，Kwon TH，et al．Schizandrin prevents damage of murine mesangial cells via blocking NADPH oxidaseinduced ROS signaling in high glucose.Food Chem Toxicol，2012，50:1045-1053.

9 Chin PY，Mak DH，Poon MK，et al.Role of cytoehrome P-450 in schisandrin B-induced antioxidant and heat shock responsesin mouse liver.Life Sci，2005，77:2887-2895.