山茶属（Camellia L.）植物叶片基因组DNA不同提取方法的比较

罗 强，恒春娜，段世华,2,3

山茶属（L.）植物叶片基因组DNA不同提取方法的比较

罗 强1，恒春娜1，*段世华1,2,3

（1. 井冈山大学生命科学学院，江西，吉安 343009；2. 井冈山大学生态环境与资源研究所，江西，吉安 343009； 3. 江西省生物多样性与生态工程重点实验室，江西，吉安 343009）

山茶属植物具有重要的经济价值。为了获得高质量的山茶属植物叶片基因组总DNA，分别采用改良的CTAB法和改良的SDS法提取山茶属植物叶片中基因组DNA。结果显示，CTAB 法提取的DNA 产率、纯度均高于SDS 法，且杂质少，无明显降解。研究结果表明，改良的CTAB法比SDS法更适合用于山茶属植物叶片基因组总DNA的提取。

山茶属；DNA提取；SDS；CTAB

获得高质量的植物基因组总DNA是开展植物分子生物学研究的基础。不同植物体由于细胞内各种化学成分存在很大的差异，甚至相同植物的不同部位DNA提取的策略可能不同[1]，因此针对特殊类群的植物或植物的特殊部位应该要有专门的DNA提取方法。目前，植物基因组总DNA提取的方法有很多种，如碱裂解法、SDS 法、CTAB法、试剂盒法等，其中SDS法和CTAB法是两种最为常用也相对经济的方法。SDS法由Dellaporta等在1983年首先建立[2]，后经过许多学者的改进用于植物基因组DNA的提取[1,3]。CTAB法由Murray等在1980年首先使用[4]，在除去DNA中的多糖物质方面效果良好。之后，Doyle在1987年建立了该DNA提取方法的完整体系并对其进行了多次改良[5]，De la Cruz等(1997)和谭晓风等(1999)对此方法也分别进行了改良[6-7]。近几年，随着DNA提取技术的不断改进和发展，多种用于DNA提取的试剂盒得到了开发，由于其方便快捷的优点而的到了广泛的使用，但由于其价格相对昂贵，特别是提取DNA的量比较少，因此，在DNA需求量比较大的研究中，比如Southern Blotting，该方法则受到了一定的制约。

山茶属（L.）植物隶属于山茶科（Theaceae），是山茶科植物中最大的一个属，具有重要的经济和社会价值。由于山茶属植物代谢物比较多，获得纯度较高的基因组总DNA比较困难，不同研究者采用的提取方法存在一定的差异，提取DNA的质量也不尽相同[7-9]。本研究利用两种不同方法对山茶属植物基因组总DNA进行提取和比较分析，目的是为了探索一种山茶属植物最佳的总DNA抽提方法，为进一步开展山茶属植物在DNA水平上的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

本研究共选取了山茶属植物三个物种（油茶（Abel）、云南红山茶Coh. Stuart）和茶梅（Thunb.））的各两份材料的幼嫩叶片用于基因组DNA 的提取，材料编号与来源信息参见表1。所有植物材料的叶片均采自井冈山大学校园内，保存于-80℃超低温冰箱备用。

表1 本研究使用的山茶属植物材料

1.1.2 仪器设备与试剂

本实验使用的主要仪器：高速冷冻离心机（德国eppendorf公司）、超低温冰箱（日本三洋）、蛋白核酸测定仪（德国eppendorf公司）、凝胶成像系统（YIN—2000，北京亚力恩机电技术研究所）等。

所有化学试剂和药品均购自相关生物技术公司，主要溶液的配置方法如下：

①CTAB提取缓冲液：2 %CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20 mmol/L EDTA，pH8.0，1.4 mmol/L NaCl，2% PVP；②SDS提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，50 mmol/L EDTA，pH8.0，500 mmol/L NaCl，1.5 %SDS，2% PVP；③TE缓冲液：10 mmol/L Tris- HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0；④10 %CTAB缓冲液：10 %CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20 mmol/L EDTA，pH8.0，1.4 mmol/L NaCl；⑤1 ×TAE电泳缓冲液：40 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2 mmol/L EDTA，pH8.0，20 mmol/L Acetic acid。

1.2 基因组总DNA提取方法

1.2.1 CTAB法[10]

参照Doyle(1990)的方法并通过改良进行，具体步骤如下：

①称取植物叶片材料约1 g于研钵中，加入液氮研磨至粉末状后，迅即转入15 mL离心管中，加入5 mL65 ℃预热的CTAB提取缓冲液，每1 mL提取缓冲液加入20 μL 2--巯基乙醇（使终浓度为2 %（V/V）），65℃水浴90 min，期间每隔10 min 摇动1次，使提取液与样品充分混合。②将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入5 mL氯仿-异戊醇（体积比为24:1），轻柔反复颠倒至充分混匀后，置摇床上轻缓摇匀30 min，6000 rpm，离心10 min。③将上清液转移至一新的15 mL离心管中，加入1/10体积65 ℃预热的10%CTAB缓冲液，轻摇混匀后，加入5 mL氯仿-异戊醇（体积比为24:1）轻摇混匀，6000 rpm，离心10 min。此步骤可重复1~2次。④加入1/10体积3M NaAc溶液，轻摇混匀后，加入等体积预冷（-20 ℃）的异丙醇，轻摇至絮状物出现，置-20 ℃冰箱1 h。6000 rpm，离心10 min，弃上清液。⑤用2 mL75%和无水乙醇各洗2次，然后将离心管放在37 ℃恒温培养箱中干燥DNA。⑥待DNA干燥后，加入400 μLTE缓冲液和5 μL RNase A于37 ℃恒温培养箱中消化RNA 2 h，置4℃冰箱1 d，然后保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 SDS法[11]

依照Edwards等（1991）的方法并做改良，具体步骤如下：

①称取植物叶片材料约1 g于研钵中，加入液氮研磨至粉末状后，迅速转入15 mL离心管中，加入5 mL65 ℃预热的SDS提取缓冲液，每1 mL提取缓冲液加入20 μL 2--巯基乙醇（使终浓度为2%（V/V）），65 ℃水浴30 min，期间每隔5 min 摇动一次，使提取液与样品充分混合。②加入1/10体积5 M KAc溶液后，剧烈震荡，冰浴20 min。③6000 rpm离心10 min 将上清液转移至一新的15 mL离心管中，加入5 mL氯仿-异戊醇(体积比为24:1)，轻柔反复颠倒至充分混匀后，置摇床上轻缓摇匀10 min，6000 rpm，离心10 min。重复此步骤1~2次。④将上清液转移至一新的15 mL离心管中，加入0.7体积预冷（-20 ℃）的异丙醇， -20 ℃冰箱沉降1 h。6000 rpm，离心10 min，弃上清液。⑤用2 mL70 %和无水乙醇各洗DNA沉淀2次。⑥待DNA干燥后，加入400 μL TE缓冲液和5 μL RNase A于37 ℃恒温培养箱中放置2 h后，然后保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 DNA样品的检测方法

对所提取的DNA样品，分别采用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法，检测其得率和质量。

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测

取2.0 μL总DNA 样品与3 μL ddH2O和1 μL 6 × Loading buffer混匀。用0.8 %琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)进行电泳，电压5 V/cm。电泳后用YIN—2000凝胶成像系统检测和照相。

1.3.2 紫外分光光度计检测

提取的基因组总DNA样品用eppendorf公司的蛋白核酸测定仪进行定量测定。取2 μL DNA样品置于比色皿中加入98 μL ddH2O，测定DNA溶液分别在260 nm、280 nm处的吸光值，记录A260、A280及A260与A280的比值（A260/A280）。通过A260值来计算DNA浓度，即浓度= 50 ng/μL × A260× 稀释倍数，通过A260/A280值计算DNA纯度。

2 结果与分析

2.1 总DNA 的电泳检测结果

两种方法所提取的山茶属植物基因组总DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。电泳结果显示，不同样品总DNA得率存在一定的差异，分析造成这种结果的可能原因是在进行液氮磨样时，样品的溅洒造成样品实际量的差异以及在DNA提取过程中的一些操作误差所致。电泳结果也显示SDS法提取的总DNA效果较差，除了样本HSC1能隐约看见DNA条带外，其余样品均未能看见总DNA电泳条带。

图1 两种不同提取方法所得山茶属植物基因组总DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.2 植物基因组总DNA 的紫外分光光度法检测结果

光吸收比值A260/A280是衡量DNA纯度的一个重要指标。在两种不同的总DNA提取方法中，SDS法所提取的总DNA的A260/A280值均比较低，介于1.11~1.60之间，其中只有样品YC1相对接近1.80。CTAB法提取的总DNA的A260/A280值均较好的接近于1.80，它们的值介于1.68~1.89之间（表2）。在总DNA得率上，CTAB法得率普遍高于SDS法，SDS法除了样品HSC1的得率较高外，其它样品总DNA的得率均较低（见表2）。分光光度计检测的结果与电泳检测的结果一致。

表2 两种不同方法提取植物总DNA的得率和纯度比较

3 讨论

纯度好的双链DNA其A260/A280值应该为1.8，提取得到DNA的A260/A280值如果在1.8左右均可认为是纯度比较高，质量比较好的DNA。如果含有一定量RNA、蛋白质、多糖、多酚和单宁类等杂质的总DNA，其A260/A280值一般会高于2.0或低于1.7。本研究所采用的两种植物基因组总DNA提取方法中，SDS法所得DNA样品的A260/A280均低于1.7，变化范围在1.11~1.60之间，表明SDS法提取的DNA含有较多的杂质，纯度较低。而CTAB法提取的总DNA的A260/A280值均在1.8左右，变法范围在1.68~1.89之间，表明CTAB法能有效地除去DNA中的大部分杂质，如多糖和蛋白质等物质，所提取的DNA杂质少，纯度较高。因此，研究结果表明改良的CTAB法是一种用于提取山茶属植物基因组总DNA较理想的方法。

木本植物叶片往往含有大量的酚类和醌类等次生代谢物，许多研究表明，常规的CTAB和SDS提取法很难将这些杂质去除[7-9, 12]。早期笔者曾试图采用常规CTAB法和SDS法提取杜鹃属叶片基因组总DNA，但均未能获得成功。PVP（聚乙烯聚吡咯烷酮）对多酚类和多醌类物质具有很好的吸附和去氧化作用。通过在CTAB提取液中加入2%的PVP，对常规CTAB法进行改良，结果能很好地去除植物DNA样本中的多酚类和多醌类物质[9, 12-13]。本研究表明，改良的CTAB法能获得质量较好的山茶属植物基因组DNA，然而加入2%PVP改良的SDS法依然不能对山茶属植物DNA进行有效提取，其原因有待于进一步探讨。

DNA产率是衡量一种DNA提取方法优劣的重要参数之一。本研究所采用的两种植物总DNA提取方法，通过紫外分光光度法测得的总DNA产率，CTAB法较SDS法要高。然而在琼脂糖凝胶电泳检测结果中，SDS法除了样品HSC1可见DNA条带外，其它样品均未见到DNA电泳带，这与紫外分光光度法检测到的结果并不能很好的吻合。刘杰等（2011）在对红豆杉属植物总DNA提取方法的比较研究中认为，较多的杂质会影响DNA的A260值，从而影响依据此值计算出的DNA产率，因此，通过紫外分光光度法测得的结果与琼脂糖凝胶电泳检测的结果不能很好的相互印证。在这种情况下利用光吸收值计算出的DNA产率不能反应DNA的真实浓度和产率，凝胶电泳检测反应的结果更为可靠些[12]。

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[13],, 胡乃凤, 等. 基于ISSR指纹标记的亚洲栽培稻与野生稻遗传多样性分析[J]. 井冈山大学学报:自然科学版, 2010, 31(1): 118-124.

Comparison of different extraction methods of genomic DNA from leaf tissues ofL.

LUO Qiang1, HENG Chun-na1,*DUAN Shi-hua1,2,3

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. Institute of Eco-Environment and Resources, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 3. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

The plants ofL. have very important economic values. In order to obtain high quality genomic DNA from leaf tissues ofL., two genomic DNA extraction methods (modified CTAB method and modified SDS method) were compared in this study, respectively. The data showed that DNA yield and purity for modified CTAB method was higher than that for modified SDS method, and the DNA samples for the modified CTAB method has less impurity and degradation. The results of this study indicated that the modified CTAB method is more suitable for genomic DNA extraction than modified SDS method from the leaf tissues ofL.

L.; DNA extraction; SDS; CTAB

Q781

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.04.009

1674-8085(2014)04-0040-04

2014-04-09；

2014-05-11

江西省自然科学基金项目(2009GZN0071)；江西省教育厅科技计划项目(GJJ12464)；井冈山大学科研基金项目

罗 强(1990-)，男，江西南康人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail: 453921137@qq.com);

恒春娜(1990-)，女，云南福贡人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail:hchn1990524@qq.com);

*段世华(1968-)，男，江西永新人，教授，博士，主要从事分子生物学研究(E-mail:shihua_duan@aliyun.com).