基于猪链球菌2型烯醇化酶建立的筛查并监控细菌侵袭性感染的ELISA方法

孙 雯，潘秀珍

基于猪链球菌2型烯醇化酶建立的筛查并监控细菌侵袭性感染的ELISA方法

*孙 雯1，潘秀珍2

（1.扬州职业大学，江苏，扬州 225000; 2.南京军区军事医学研究所，江苏，南京 210002)

探索猪链球菌2型（2）重组烯醇化酶（Enolase）蛋白的免疫学特性，建立调查2 侵袭性感染的标记和方法，并用于人群及猪群中2 感染的监控和筛选有效的疫苗抗原。PCR 法检测在各血清型菌株中的分布情况，免疫印记检测 Enolase 的免疫反应性，建立筛查2 感染的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。PCR 检测显示在多种血清型中广泛存在，Western-blot 表明重组Enolase 蛋白具有较好的免疫反应性。基于 Enolase 建立的 ELISA 结果显示，感染2 的猪血清中Enolase 抗体效价较高。基于Enolase 建立的ELISA 方法能有效地用于2 感染的筛查和监控。

猪链球菌2型（2）；烯醇化酶Enolase；酶联免疫吸附试验；ELISA

猪链球菌2型(2）是重要的人畜共患病原菌。迄今为止，2 已在20多个国家和地区导致了200多起人群的恶性感染事件，造成的临床疾病包括脑膜炎、败血症、关节炎等[1]。尤为值得关注的是，江苏（1998年）、四川（2005年）两省暴发了2 大规模流行感染猪和人的疫情，病人临床表现为国内外罕见的中毒性休克综合征（STSS）[1-2]。2 致病机理复杂，虽有诸多研究，但尚未明确。目前，也缺乏有效的疫苗及方法预防并检测猪链球菌病。细菌的表面成分不仅涉及细菌的防御机制，同时也与细菌的毒力有密切关系，例如黏附、定植、侵袭、组织中的穿梭等[3-4]。近来发现烯醇化酶（Enolase，ENO）不仅在细菌体内参与基础代谢，也能出现在多种病原菌胞外参与感染过程[5-6]。

抗体水平的免疫监控是疾病预防控制的一项重要措施，但目前国内外还没有研制出快速、可靠、稳定的检测2 特异性抗体的免疫学方法。有关课题组前期已成功表达出2 中国强毒株 05ZYH33 的融合蛋白His-ENO[7-8]，本研究将进一步探索 Enolase 蛋白免疫学特性，旨在基于 Enolase 建立临床调查2 侵袭性感染的酶联免疫吸附（ELISA）检测方法用于人群及猪群中2 感染的监控，为后续2 以及2 以外多个血清型致病机理的研究和相关预防监测奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

2（98T003、98012、HAbb、ZY05、HA68、261、266来自中国，S735来自加拿大，SS2-N 来自德国，T15来自荷兰）10株；血清型标准参考株31株（加拿大Marecelo Gottschalk教授惠赠）；2 05ZYH33 重组Enolase蛋白、兔抗 05ZYH33 抗血清为本实验室制备；恢复期SPF猪血清（阳性对照），未感染的SPF猪血清（阴性对照）为本实验室保存；86份猪血清采集于江苏的农场和屠宰场；硝酸纤维素膜为Amersham Pharmacia Biotech产品；酶结合物HRP标记羊抗兔IgG、酶结合物HRP标记羊抗猪IgG（Sigma）；OPD（O-phenylenediamine）（Amresco）；96孔ELISA板（Greiner bio-one Germany）。

1.2 方法

1.2.1基因在各血清型和非菌株中的分布

以多种国际血清型、国内外2 的基因组为模板，PCR扩增目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳分析。引物由上海基康生物有限公司合成，上游引物为：

5-GCGGATCCATGTCAATTATTACTG-3；下游引物为：5-GCCTCGAGTTATTTT TTCAAGTTGTAG-3。

1.2.2 Enolase 蛋白的 Westernblot 分析

采用电转印法。将 12% SDS-PAGE 电泳后胶上的重组蛋白 Enolase转移(转印缓冲液: 39 mmol/L甘氨酸，48 mmol/L Tris Cl，0.037% SDS，20% 甲醇）至硝酸纤维素膜上，5% 脱脂奶封闭1 h。TBST（10 mmol/L Tris Cl，0.9% NaCl，0.5% Tween20，pH 7.5）洗三次，加兔抗 05ZYH33 抗血清（1: 100）37 ℃孵育 1 h。TBST 洗三次，再加 HRP 标记的羊抗兔 IgG（1: 1000）37 ℃孵育 1 h。TBST 洗三次，DAB 显色（邻苯二胺 DAB 6 mg，0.3% CoCl21 mL，30% H2O210 μL），待有条带出现，立即用蒸馏水清洗以终止反应。

1.2.3 Enolase 抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的建立

1.2.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

Enolase蛋白和2 全菌超声波破碎后作为抗原分别按10、5、1、0.5、0.1 μg/mL的浓度，置4℃包被过夜。SPF 猪阳性和阴性对照血清按1: 100倍比稀释至1: 800，分别加到不同浓度包被的孔里，37°C孵育1 h。加入HRP 标记羊抗猪IgG（1: 1000），37 °C孵育1 h。底物显色，酶标仪读取490 nm波长下OD值。P为阳性血清OD值，N为阴性血清OD值，以P值接近1、P/N值最大时抗原的稀释倍数为抗原最佳工作浓度，此时对应的血清稀释度为最佳血清稀释度。

1.2.3.2 二抗最佳稀释浓度和作用时间的确定

将抗原按最佳工作浓度包被酶标板，洗涤后加最佳稀释度的SPF猪阳性和阴性对照血清，37℃作用1 h。酶标记的羊抗猪 IgG 按1: 1000倍比稀释至1: 4000，每个稀释度做3个复孔。37 ℃分别作用45、60、90 min，显色后490 nm波长测定OD值。以阳性血清 OD 值接近1、P/N 值最大时酶结合物的稀释浓度为二抗最佳工作浓度和最佳作用时间。

1.2.3.3 最佳包被液、封闭液的确定

分别用0.01 M PBS（pH7.4），1M Tris-Cl（pH=8.0）和0.05 M碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液（pH=9.6）稀释抗原至最佳工作浓度进行包被，加最佳稀释度的阳性和阴性对照血清、最佳工作浓度羊抗猪IgG，以OD值接近1、P/N 值为最大为最佳包被液。未包被抗原的酶标孔分别加入 PBST 稀释的5 % 脱脂奶粉、1 % BSA、2 % 明胶（复孔），37℃作用2 h，加最佳稀释浓度猪阳性对照血清、最佳稀释浓度羊抗猪IgG，以OD值最低为最佳封闭液。

1.2.3.4 Enolase 抗体的 ELISA 检测及结果的判读

将重组Enolase蛋白和2全菌超声裂解蛋白按各自最佳工作浓度包被96孔酶标板。分别加入最适封闭液、最佳稀释度的SPF猪阳性对照血清和阴性对照血清（各10份）、最佳浓度的羊抗猪IgG，酶标仪读取490 nm波长的OD值。P 为10份阳性血清孔的 OD 平均值，N 为10份阴性血清孔的OD平均值，计算/值。用上述方法检测86份采集于江苏农场和屠宰场的待测猪血清，P’值为待检血清孔的OD值，将P’/ N值大于P / N值的样本判定为感染阳性样本。

2 结果

2.1 PCR分析 enolase 基因在 S. suis 血清型中的存在情况

PCR法分别对多个血清型的标准参考株和国外的2 型3株（S735、SS2-N 和 T15）、国内分离的2 型61株进行扩增，结果除了7、29、31和32型以外，其余包括1、2、1/2和9型在内的27个血清型都扩增出目的条带；2株国外2 型分离株和58株国内2 型分离株全部扩增出目的条带，而无毒株2 T15 中没有扩增出目的条带（结果如表1）。

表1 PCR 检测eno 基因在各菌株中的分布

+: positive; --: negative;溶血素基因荚膜多糖基因溶菌酶释放蛋白基因；胞外蛋白因子基因

2.2 Enolase 蛋白的 Western blot 分析

Western blot 结果显示，重组 Enolase 蛋白可以与全菌兔抗 05ZYH33 抗血清反应，在特定位置处有明显的条带（图1），表明重组 Enolase 蛋白具有较强的免疫反应性。

1:蛋白标记物，2:重组Enolase与全菌兔抗 05ZYH33 抗血清结合条带

2.3 基于S. suis 2 Enolase蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法的建立和应用

2.3.1 E LISA 检测最佳条件的确定

经方阵结果筛选显示，Enolase最佳包被浓度为0.5 μg/mL，猪血清最佳稀释度为1: 200；全菌超声波抗原最佳包被浓度为5 μg/mL，猪血清最佳稀释度为 1: 100。HRP 羊抗猪 IgG 最佳稀释度为1: 1000，作用时间为1 h。不同的包被液包被抗原，P/N 值相差不多，但碳酸盐缓冲液包被时阴性值最小，故选择 0.05 M 碳酸钠和碳酸盐缓冲液（pH=9.6）为最佳包被液。封闭液为5%脱脂奶粉时阴性值最低，P/N值最大。

2.3.2 猪血清 ELISA 检测结果

以重组Enolase 为包被抗原，已知10份阳性猪血清和10份阴性猪血清的OD490平均值(和)分别为0.578和0.275，二者的比值为2.1。ELISA检测86份猪血清样品，将待测样本值P’与的比值≧2.1的样本判定为阳性感染样本(图2)，结果显示该方法可以清楚地分辨阳性、可疑的和阴性样本。

——阳性基准线 ------阴性基准线

（基于ENO建立的对于猪血清样本的ELISA检测.86份猪血清采集于江苏的农场和屠宰场）

3 讨论

35 种血清型中，1、2、1/2、9型是主要致病血清型，尤其是2型流行最广、致病性最强。本研究中，通过 PCR 分析基因在不同血清型中的存在情况，结果显示基因在包括1、2、1/2和9型在内的27个血清型，以及来自不同地理区域的多株2分离株中普遍存在，表明有可能作为感染2 及其他致病型的流行病学监测的检测指标。免疫印记显示 Enolase 可以与全菌兔抗 05ZYH33 抗血清反应，说明Enolase 具有很好的免疫反应性[5]。由于基因存在于大部分血清型中，表明重组 Enolase 在建立感染的血清学诊断方面具有潜在的应用价值。

抗体水平的免疫监控是疾病预防控制中的一项常用重要措施，基于荚膜多糖的间接ELISA（CPS-ELISA）曾用于2感染仔猪的血清中抗CPS抗体的检测，但发病猪和非发病猪间的抗体滴度无明显差异。本实验通过对检测体系的最适条件进行优化，基于Enolase建立了一个有效筛查2感染的ELISA方法，将能够很好地应用于实验室、临床及野外对2感染的监测。

本研究结果表明Enolase在建立2感染的血清学诊断方面具有一定的应用价值，基于Enolase建立的筛查2感染的ELISA方法，将能很好地应用于人群及猪群中2 感染的监控。此外，该研究为深入探索2及2 以外多个血清型的致病机理、建立快速可靠的免疫学检测方法提供了思路。

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AN ELISA METHOD BASED ON RECOMBINANT ENOLASE SCREENING AND INVASIVE INFECTION MONITORING OF2

*SUN Wen1, PAN Xiu-zhen2

（1.Yangzhou Vocational College, Yangzhou, Jiangsu 225000, China; 2. Institute of Military Medical Sciences, Nanjing Command, Nanjing, Jiangsu 210002, China)

：To study the immunological characters of recombinant Enolase from2, establish a mark and a method for investigating its invasive infection and apply them in monitoring its infection and screening valid vaccine antigen among crowd and swinery.：PCR was adopted to analyze the distribution ofgene in all kinds ofserotype, western-blot experiment was used to detect the immunoreactivity of Enolase, and eno-based ELISA method was established for screening2 infection.：PCR results showed thatgene widely existed in many serotypes of, western-blot experiment demonstrated recombinant Enolase had stronger immunoreactivity. Evaluation of Eno-based ELISA indicated that serum samples from pigs with2 infection have higher levels of antibody titers.: ELISA provided an efficient Eno-based method for screening and monitoring the infection of2.

serotype 2 (2); enolase; ELISA

S855.99

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.04.017

1674-8085(2014)04-0080-04

2014-03-17；

2014-05-11

国家自然科学基金项目(30670105、30600533)；国家863计划项目(2006AA0Z455)；江苏省科技计划项目（自然科学基金项目）(BK2007013)

*孙 雯(1983-)，女，江苏扬州人，讲师，硕士生，主要从事基础医学的教学与科研工作(E-mail：wen-sun@163.com);

潘秀珍(1962-)，女，江苏南京人，研究员，博士，主要从事流行病学的科研工作(E-mail：panxiuzhen-2004@163.com).