甲胎蛋白阴性肝癌射频消融治疗前血清中转移相关miRNA的临床价值

占美晓， 李 勇， 胡宝山， 何 旭， 黄建文， 陆骊工

近年来，以射频消融术（RFA）为主的微创治疗在早期肝癌治疗中的疗效越来越得到认可。然而研究发现RFA术后的5年复发率却可高达70%，术后高复发率已成为影响患者RFA术后远期疗效的重要因素［1-2］。 对于血清甲胎蛋白（AFP）升高的肝癌患者，AFP常作为肿瘤标记物以预测肿瘤复发或预后。临床上仍然有30%～40%患者AFP阴性（≤20 ng/ml），对此类患者，目前尚无理想的肿瘤标记物［3］。 microRNA（miRNA）是一类进化上高度保守的非编码单链RNA，可影响细胞发育、分化、干细胞功能等多种病理生理过程，在肿瘤发生和转移过程中亦发挥重要作用。近年，诸多研究已经证实肿瘤组织中高表达的miRNAs可以释放到循环血液中，且表达稳定，循环miRNAs（血清或血浆等）被广泛用于理想的肿瘤标记物［4-5］。本研究选择的转移相关miR-18b在肝癌组织中高表达且与肿瘤复发预后密切相关［6］，本研究重点探索miR-18b是否可以作为肿瘤标记物去监测AFP阴性肝癌患者RFA术后复发。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2007年1月—2011年1月，我科诊治的接受RFA治疗的AFP阴性肝癌患者131例，收集患者RFA治疗前1～2 d的血清标本。肝癌诊断标准根据卫生部制定的原发性肝癌诊疗规范（2011年版），所有患者均行肝穿刺活检病理确诊为肝细胞癌。RFA治疗仪器采用RITA射频治疗系统（美国）。纳入的患者中男98例，女33例，平均年龄57.6岁；87例患者单病灶，44例患者多病灶 （2个或3个）；肿瘤平均直径3.2 cm。我们选取43例健康体检者的血清标本作为对照组，包括男31例，女12例。本研究获得医院伦理委员会的批准且所有纳入的研究者均获得知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 本组患者在RFA术前1～2 d采集静脉血标本约8 ml，室温下静置30 min，静置后于4℃1 500 r/min离心10 min。将上层血清吸出移至新的1.5 ml EP管，放置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 血清miR-18b的检测 所有血清样本放置于冰上，每个样本取300 μl转移至含有750 μl TRI Reagent BD的新EP管中，依据TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）说明书抽提总 RNA，所有RNA通过分光光度计检测并定量，提取好的RNA保存于-80℃冰箱内。采用实时定量PCR技术检测miR-18b 表达量［7］， 反转录总反应体系为 18 μl，PCR总反应体系为 19 μl。选择 U6作为内参基因，miR-18b的相对表达量用 2-ΔΔCT表示， 其中ΔCT肝癌患者/健康正常人= CTmiRNAs- CTU6；ΔΔCT =ΔCT肝癌患者- ΔCT健康正常人。

1.2.3 随访 随访截止时间为2012年5月。所有患者术后1个月行腹部增强CT观察消融效果，RFA术后未能达到肿瘤完全消融的患者被排除于本研究。其后每3个月行腹部增强CT检查及血清检测AFP及肝功能指标以判断有无出现复发或转移。RFA术后复发形式主要有肿瘤局部进展、肝内远处复发及肝外转移。

1.3 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，两组血清miR-18b的表达差异及其同临床病理资料间的关系用t检验或秩和检验。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验分析miR-18b表达量同患者总生存率及无复发生存率的关系。数据分析采用SPSS13.0统计软件，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-18b在肝癌患者中表达差异及相关的临床病理因素

miR-18b在AFP阴性肝癌患者血清中表达水平显著高于健康正常人（2.93±1.33对1.08±0.45，P＜0.01，图1）。超过85%患者miR-18b表达上调的倍数在2倍以上。所有131例患者中，血清miR-18b表达水平上调的中位倍数为2.7倍。以3倍为分界点，我们将131例肝癌患者分为高表达组（66例）和低表达组（65例）。研究结果显示：miR-18b表达水平差异与肝硬化、肿瘤直径及肿瘤分化程度密切相关，而与性别、乙肝表面抗原、肿瘤数目等无明显相关性（表1）。

2.2 血清miR-18b与肝癌患者RFA术后复发之间的关系

截止至末次随访日，共有79例患者（60.3%）出现复发。肝内复发70例，包括13例肝内肿瘤局部进展和57例肝内远处复发。16例出现肝外转移，其中7例合并肝内远处和肝外转移。结果显示出现复发患者血清miR-18b的表达水平显著高于无复发患者（3.26± 1.28比 2.42±0.86，P ＜0.01，图 1）。根据复发的不同形式，进一步分析两组血清miR-18b表达水平与复发率之间的关系显示：miR-18b高表达组患者RFA术后肝内远处复发率 （P=0.018）和肝外转移发生率（P=0.102）均高于低表达组（表2），而两组在肿瘤局部进展发生率上无差异 （P=0.792）。

图1 肝癌患者及健康正常人血清中miR-18b的表达水平

2.3 血清miR-18b与总生存率及无复发生存率的关系

表1 血清miR-18b表达高低同肝癌患者临床病理因素间的关系

表2 血清miR-18b同RFA术后不同复发形式发生率之间的关系 n（%）

肝癌患者 1、3、5年总生存率分别为 86.3%、63.4% 、43.5% ；1、3、5 年 无 复 发 生 存 率 分 别 为64.9%、41.7%、29.0%。Kaplan-Meier生存分析显示miR-18b高表达组患者总生存率和无复发生存率均显著低于低表达组患者，差异均具有统计学意义（见图 2）。

3 讨论

图2 miR-18b高低表达与RFA术后有无复发的比较

Kao 等［8］报道对于 AFP 升高的患者，RFA 术前术后AFP的变化可以预测肝癌患者的复发及总生存率。对于AFP阴性肝癌患者，有报道显示血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等肿瘤标记物可以用来预测外科切除或肝动脉化疗栓塞（TACE）术后肿瘤复发或转移［9-10］。 本研究重点探索可以用于预测AFP阴性患者RFA术后肿瘤进展、预后的标记物，对判断RFA术后患者的远期疗效意义重大。

血清miRNAs为肿瘤标记物的探索提供了新的视角。相比肿瘤组织取材，血清取样具有创伤小、操作简便、可重复性等优点。本研究结果显示肝癌患者血清中miR-18b的普遍高表达，且与肝硬化、肿瘤直径及肿瘤分化程度相关。此研究结果与前期Murakami等［6］在肿瘤组织中观察到 miR-18b的表达规律相一致。诸多证据已证实肿瘤组织或细胞内特异的miRNAs在细胞破坏或病理损害的过程中会释放到循环血液中，而在血清或血浆中稳定表达［11-12］。肝癌RFA治疗后肿瘤组织缺血、坏死，部分肿瘤细胞凋亡或停止增殖，因此我们有理由推测血清中高表达的miR-18b可能来自肿瘤组织热消融过程中组织坏死释放入血液中，血清miR-18b表达水平差异或可一定程度上反映肿瘤的消融坏死情况。

血清miRNAs除了可以用于肿瘤疾病的诊断外，如前列腺癌［13］、胃癌［5］等，还可以用于肿瘤患者不同方法治疗后的疗效评估。Zhao等［14］发现血浆miR-221可以预测乳腺癌患者新辅助化疗的耐药性的出现；Jung等［15］研究提示乳腺癌患者血浆miR-210表达水平显著升高，且和曲妥珠单抗药物敏感性、淋巴结转移等密切相关。Murakami等［6］研究提示miR-18b通过调控靶基因TNRC6B的表达，在肝癌细胞转移、血管侵犯、肿瘤进展等方面扮演重要角色，组织中高表达miR-18b或低表达TNRC6B的患者预后差，无复发生存率显著降低。本研究通过结合特殊临床特征的（AFP阴性）肝癌患者RFA术前血清miR-18b的表达水平和RFA术后复发转移预后的情况进行分析，发现血清中高表达的miR-18b与RFA术后高复发率之间密切相关，且可以作为肿瘤标记物去预测肝癌患者RFA术后无复发生存率。除无复发生存率外，本研究结果也提示血清中miR-18b高表达的患者预后差，总生存率显著低于表达组患者。

综上所述，本研究结果提示血清miR-18b具有成为肝癌理想肿瘤标记物的优势，可用以监测AFP阴性肝癌患者RFA术后复发和预测患者总生存率。miRNAs在肿瘤发生发展中调控的基因网络复杂，常既充当“癌基因”又可充当“抑癌基因”的角色，因此在本研究的基础上，以下问题后续仍需继续探索：肝癌患者血清中其他转移相关miRNAs（miR-151、miR-222、miR-30 d）的临床价值的探索；能否联合其他类型肿瘤标记物 （VEGF、缺氧诱导因子-1a等）去判断肿瘤进展及预后；扩大样本量，进一步验证血清miR-18b的价值以便真正转化临床，使患者受益。

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