紫背金盘中痢止蒿甲素、β-蜕皮激素、8-乙酰基哈帕苷的测定

梁晓岚，易刚强，何桂霞，干 丽，李嘉滢，李云耀

(湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208)

紫背金盘为唇形科筋骨草属植物紫背金盘Ajuga nipponensis Makino的全草，又名散瘀草、散血丹，为我国传统中药材，具有清热解毒、凉血散瘀、抗炎消肿止痛之功效。民间常用紫背金盘及其同属植物治疗肺热咳嗽、咽喉肿痛、痈肿疮疖及各种炎症［1-2］。现代药理作用研究发现紫背金盘还具有解热、镇痛、抗炎、抑菌，抗肿瘤，降压等多种活性［3-9］。其主要化学成分类型有二萜类、环烯醚萜类、甾体酮类［10-11］，紫背金盘中相关成分的定量测定方法尚未见报道。本实验选取了痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷3种具有显著药理作用的成分进行HPLC分析，建立HPLC定量测定方法，为紫背金盘药材质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪 (安捷伦化学工作站)、TU-1900双光束紫外可见分光光度计 (岛津仪器有限公司)、分析天平 (岛津AUW220D，十万分之一);紫背金盘采集于湖南省宁乡县，批号为20110503、20120507、20130505，经湖南中医药大学彭菲教授鉴定为唇形科筋骨草属植物紫背金盘Ajuga nipponensis Makino的全草，标本存于湖南中医药大学中药化学教研室。药材常温下阴干后粉碎，过20目筛，得细粉，备用。痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷对照品由湖南中医药大学中药化学教研室从紫背金盘全草中分离纯化所得，经HPLC测定纯度大于99%。乙腈为色谱纯 (Sigma公司)，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 SinoChrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为25℃，体积流量0.8 mL/min。痢止蒿甲素检测波长为228 nm，流动相为乙腈-水 (70∶30);β-蜕皮激素检测波长为243 nm，流动相为乙腈-水 (18∶82);8-乙酰基哈帕苷检测波长为212 nm，流动相为乙腈-水(13∶87)。痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷对照品在各自色谱条件下分别在19.791、21.762、16.591 min处出峰，样品中相关检测对象的色谱峰保留时间均与对照品保留时间一致，且与其他峰分离度好，结果见图1～图3。

图1 痢止蒿甲素对照品 (A)和供试品 (B)HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of reference substance of ajuforrestin A(A)and sample(B)

图2 β-蜕皮激素对照品 (A)和供试品 (B)HPLC色谱图Fig.2 Chromatograms of reference substance of ecdysterone(A)and sample(B)

2.2 对照品溶液制备 精密称取痢止蒿甲素3.0 mg、β-蜕皮激素 5.0 mg和 8-乙酰基哈帕苷10.0 mg，分别置于25 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即配得0.12 mg/mL的痢止蒿甲素标准液、0.2 mg/mL的β-蜕皮激素标准液和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷标准液，进样前分别过0.45 μm微孔滤膜即可。

图3 8-乙酰基哈帕苷对照品 (A)和供试品 (B)HPLC色谱图Fig.3 Chromatograms of reference substance of 8-o-acetylharpagide(A)and sample(B)

2.3 供试品溶液制备 取紫背金盘药材粉末3份，每份约取5.0 g，精密称定，分别置于500 mL圆底烧瓶中，加入50倍量95%的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶剂至干得3份醇提浸膏。取适量甲醇将3份浸膏溶解并分别定容至25 mL、25 mL、100 mL，分别作为痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷的样品溶液。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为0.12 mg/mL的痢止蒿甲素、0.2 mg/mL的β-蜕皮激素和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷对照品2、6、10、14、18、20 μL，按 “2.1”项下的色谱条件分别测定，以色谱峰面积值 (Y)对进样量 (X，μg)进行线性回归，得痢止蒿甲素回归方程为Y=4619.8X+127.43(r=0.9984);β-蜕皮激素回归方程为Y=2046.7X+13.219(r=0.9962);8-乙酰基哈帕苷回归方程为Y=246.01X+32.18(r=0.9986)。结果表明，痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷分别在0.24 ～2.40 μg，0.40 ～4.00 μg，0.40 ～ 4.00 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，每次20 μL，分别测定其色谱峰面积。痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷峰面积的RSD分别为0.31%、0.54%和0.82%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液在0、6、12、18、24 h分别进样20 μL，测定各成分峰面积。结果6次进样痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷峰面积的RSD分别为0.41%、0.60%和0.84%，结果表明供试品在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 精密称取同一批紫背金盘药材粉末 (批号20130505)6份，按“2.3”项下供试品溶液制备方法，平行制备痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷的样品溶液各 6份，按“2.1”项下色谱条件，进样20 μL，测定各成分峰面积的RSD依次为0.42%，0.64%，0.75%，表明本方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精密称定已知含有量的同一批紫背金盘药材粉末 (批号20130505)9份，每份约1.0 g，分别加入一定量的对照品溶液，各平行3份，按“2.3”项下供试品溶液制备方法操作，在“2.1”项的色谱条件下，分别进样20 μL，测定各成分峰面积，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品测定 取3批紫背金盘药材样品，按“2.3”项下样品溶液的配制方法，分别配制痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷的样品溶液，在“2.1”项的色谱条件下，分别进样20 μL，测定各成分峰面积并计算，结果见表2。

表2 紫背金盘中痢止蒿甲素、β-蜕皮激素、8-乙酰基哈帕苷的量 (n=3)Tab.2 Content determination of ajuforrestin A，ecdysterone and 8-O-acetylharpagide in Ajuga nipponensis Makino(n=3)

3 讨论

3.1 检测方法的确定 通过用紫外检测器对痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷的对照品溶液进行全波长扫描，分别在228 nm、243 nm和212 nm处有最大吸收，3个成分没有共同的较大的吸收波长，故选取228 nm作为痢止蒿甲素的检测波长，243 nm作为 β-蜕皮激素的检测波长，212 nm作为8-乙酰基哈帕苷的检测波长。同时检测3个成分的方法有待于进一步探索。

3.2 紫背金盘质量控制探讨 选取痢止蒿甲素、β-蜕皮激素和8-乙酰基哈帕苷3种具有显著药理活性的化学成分，采用高效液相色谱法测定其在紫背金盘药材中的含有量，方法专属性较强、重复性好。实验结果显示痢止蒿甲素和β-蜕皮激素在药材中的量相对较低，而8-乙酰基哈帕苷的量较高，达到了0.28%，可考虑将此成分作为紫背金盘药材鉴定及质量控制的重要指标成分。

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