去氢骆驼蓬碱通过诱导凋亡发挥抗肿瘤药理作用研究进展

顾 帆，顾月清

(中国药科大学，江苏南京 210009)

骆驼蓬Peganum harmala L.是多年生草本蒺藜科骆驼蓬属植物，是我国维族、蒙古族常用药材，被列入卫生部药品标准维吾尔族分册。主要分布于我国西北地区，在中东、中亚、地中海沿岸、南美也有分布。骆驼蓬性平，味苦、辛，有毒，具有坚固筋脉、助阳暖阴、消散寒湿气等功能，主治筋脉软弱、骨关节痛、咳嗽痰多、偏瘫健忘、神昏头痛、月经不调等症［1］。种子和全草均具有药用价值，其主要活性成分有去氢骆驼蓬碱 (harmine)、骆驼蓬碱 (harmaline)和去甲骆驼蓬碱 (harmalol)等。

去氢骆驼蓬碱 (7-甲氧基-1-甲基-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚，harmine)，又称肉叶云香碱，淡黄色针状晶体，分子量为212.25，分子式为Cl3H12N20，是一种三环β-咔啉类生物碱，结构式如图一所示。harmine在自然界中分布广泛，包括各种植物、海洋生物、昆虫等，最早于1874年被人们从植物Peganum harmala的种子中提取得到。它在骆驼蓬种子中的含量较高，结构稳定。研究表明，harmine具有抗菌、抗疟原虫、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤、抗诱变、细胞毒、致幻等一系列药理作用［2］。

图1 去氢骆驼蓬碱的结构

1 Harmine的抗肿瘤作用

随着对harmine单体化合物药理作用研究的进一步深入，越来越多的实验证实该化合物对多种肿瘤模型具有明确的抑制作用。

体外细胞实验发现，harmine对宫颈癌细胞HeLa、S-180、胃癌细胞 MGC-803和 HGC27、肝癌细胞 BEL-7402、鼻咽癌细胞CNE-2、人胰腺癌细胞AsPC-1、白血病细胞K562、小鼠结肠癌细胞Colon26等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用［3］。Jahaniani等采用MTT法检测 harmine的抗癌活性，发现其对人类肿瘤细胞 (HL60，K562，HeLa，KB，A549，Saos-2，A2780-CP，A2780-S，MCF-7，A375，A172等)具有广泛的细胞毒性［4］。

Liu等研究表明，harmine盐酸盐能够显著阻碍初级及次级神经球形成，诱导神经胶质瘤细胞GSLCs分化，并降低GSLCs的干性，发挥抗胶质瘤作用［5］。而在Zhang等的研究中，harmine表现出对胃癌细胞迁移与侵袭的抑制效果［6］。

体内抗肿瘤研究结果表明，harmine对S-180小鼠、网织细胞肉瘤L2和小鼠肝癌都有显著的疗［7］;可通过抑制血管形成，抑制裸鼠的肺癌细胞A549细胞异种移植瘤［8］;对大鼠体内接种的胶质母细胞瘤也有较好的生长抑制效果［6］。

另外，harmine与顺铂、阿霉素联用具有协同抗肿瘤效果［9］。与米托蒽醌、喜树碱等联用，能够通过减少细胞BCRP(乳腺癌耐药蛋白)依赖的外排作用，大幅度降低它们对BRCP高表达细胞的半数抑制率 (IC50)，恢复其对抗癌药物的敏感性［10］。

2 Harmine诱导肿瘤细胞凋亡的作用

细胞凋亡 (apoptosis)是细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)的一种形式，即在一定生理病理条件下，机体通过基因水平的调控，使细胞主动死亡以维护内环境稳定的过程，于1972年由Kerr等根据形态学特征首次提出［11］。

2.1 Harmine诱导肿瘤细胞凋亡的检测方法 随着技术的进步，新的细胞凋亡检测方法不断涌现，对于凋亡细胞的检测趋近快速而准确。大量研究通过多种检测手段，例如形态学观察、电泳法、原位末端转移酶标记法、流式细胞技术等，确证了harmine能够通过诱导细胞凋亡的方式发挥抗肿瘤效果。

2.1.1 形态学观察 凋亡细胞的形态变化包含以下几个方面的特征:细胞体积变小，细胞质浓缩，核染色质固缩于核膜边缘，DNA降解，多个凋亡小体形成，并被周围细胞吞噬消化［12-13］。刘俊玲等研究发现，harmine作用Jurkat细胞48 h后细胞后，进行Wright-Giemsa染色，观察形态发生了明显改变，染色质分布不均，呈致密浓染的块状，核膜增厚，核固缩碎裂，细胞形态基本完整。而未加药物组细胞体积大，外形较规则，核呈圆形或椭圆形，核染色质疏松细致，呈蓝紫色，核仁大而清晰，胞浆丰富［14］。李强等使用Hoechst 33258染色可见，harmine作用后的HepG-2发生细胞核固缩边聚裂解，凋亡小体形成等凋亡形态学变化［9］。Hamsa等以苏木精、署红染色B16F-10细胞后观察，细胞膜起泡、染色质浓缩、DNA碎裂，同样有凋亡小体出现［15］。

2.1.2 电泳法 凋亡发生时Ca2+和Mg2+水平升高可激活细胞内核酸内切酶，导致细胞核DNA双链断裂，形成180～200 bp的整数倍的寡核苷酸片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以观察到典型的梯型条带。利用这种现象，DNA梯形条带法至今仍作为最可靠的凋亡检测手段被广泛应用［16］。研究人员从 harmine作用的 HepG-2、B16F-10、SGC-7901、Jurkat、U937、HL-60等细胞中抽提得到DNA，电泳后均呈现不连续DNA的梯状连续条带，表明片段化的形成，证实了 harmine 诱导凋亡的发生［15，17-19］。

单细胞凝胶电泳 (Single cell gel electrophoresis)又称彗星实验 (Comet assay)。细胞经裂解后，受损的DNA能在碱性电泳液作用下解旋后产生DNA断片，在荧光显微镜下呈现彗星影像。反之，未受损伤的DNA，染色后呈圆形斑点无拖尾现象。Boeira等采用彗星实验考察了harmine诱导V79细胞凋亡的作用，与对照组相比，harmine在所有浓度下均表现出凋亡特有的DNA损伤指数以及损伤频率显著提升的趋势［20-21］。

2.1.3 原位末端转移酶标记法 原位末端转移酶标记法(TUNEL assay，Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay)的原理是利用凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3'末端，从而进行凋亡细胞的检测。相反，正常细胞因为几乎没有DNA断裂缺口，所以不产生3'-OH，无法被染色［16］。Hamsa等利用TUNEL法检测harmine给药后B16F-10细胞的生长情况，观察到大量TUNEL阳性细胞 (判定为凋亡细胞)，并通过观察进一步确认了凋亡导致的细胞核浓缩现象［15］。

2.1.4 流式细胞技术 流式细胞技术可以作为定性和定量检测细胞凋亡的方法，具有操作简单、快速和敏感度高等优点，该法的基本原理是细胞在通过流式细胞仪激光焦点时可以发生光散射，产生前向散射光 (FSC)和侧向散射光 (SSC)，前者强度与细胞大小有关，后者强度与质膜和细胞内部的折射率有关。凋亡细胞的FSC减小，而SSC增大;坏死的细胞FSC和SSC都会增大;而正常细胞FSC增大，SSC减小。因此，通过对散射光的分析，可以对三种细胞进行检测和区分［16］。李强等用Annexin V-PI双染法检测HepG-2细胞早期凋亡率，加药组细胞出现明显的亚二倍体凋亡峰，随着harmine浓度的增大，HepG-2细胞的亚二倍体百分率增加，表明harmine可能是通过启动凋亡途径抑制肿瘤细胞的增殖的。而仅用PI染色的HepG-2细胞，通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示S期及G2/M期数量提升，同时G0/G1期数量下降，即harmine对细胞周期产生G2/M期阻滞效果［17］。宋震亚等用harmine作用于SGC-7901细胞后进行PI染色，通过流式细胞仪测得细胞周期的G1期前亚二倍体的凋亡峰均显著增强，显示harmine对SGC-7901细胞具有明显的促进凋亡作用［18］。张晓凯等将harmine作用于胰腺癌AsPC-1细胞，经Annexin V-FITC/PI双染后由流式细胞仪检测发现，与对照组相比，各组给药细胞的晚期凋亡及坏死细胞群均显著增多［22］。

2.2 Harmine诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 harmine诱导细胞凋亡的作用机制虽然尚未得到完整确切的阐明，但harmine对参与细胞凋亡的一系列重要调控分子 (如caspase、bcl-2、p53、PARP等)所产生的作用受到了研究者们的广泛关注。

2.2.1 Caspase与凋亡信号转导通路 细胞凋亡的信号转导至少存在内、外源性两条途径。内源性途径中，线粒体受到细胞内外传来刺激，释放细胞色素C并与Apaf-1形成多聚体，继而连续激活caspase-9以及caspase-3，启动凋亡级联反应。外源性途径包括TNFR途径与Fas/FasL途径，分别经由caspase-8与FADD的激活，启动下游的caspase相关蛋白酶活化反应［24］。可见caspase家族蛋白，尤其是caspase-3和caspase-8，在肿瘤细胞凋亡信号转导通路的各个阶段广泛发挥着不可替代的作用［23-24］。Cao等采用Western-Bloting法考察了harmine作用HepG-2细胞后的蛋白表达情况，可以观察到caspase-3和caspase-9的前体裂解与活化［17］。张晓凯等发现在AsPC-1细胞中caspase-3的表达也能被harmine抑制［22］。而采用RT-PCR考察mRNA基因表达分析显示，harmine作用后的 B16F-10后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达在给药后短时间内即显著提升［15］。上述结果表明harmine对内、外源性的细胞凋亡通路上caspase分子都能产生作用，并且可能是凋亡机制的启动诱导因素。

2.2.2 bcl-2基因 bcl-2家族分为抗凋亡基因 (bcl-2、bcl-xL、Mcl-1等)和促凋亡基因 (Bax、Bid等)两类。它们调节线粒体PT孔的开放与闭合，从而控制线粒体跨膜电位的变化，在凋亡途径中发挥至关重要作用［25-26］。研究表明，harmine作用于白血病细胞U937、HL-60、Jurket细胞后，随药物浓度的增大bcl-2蛋白的表达量降低，提示Bcl-2在harmine诱导白血病细胞凋亡的信号途径中是重要的调控因子［19］。bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体(bcl-2/Bax)与同二聚体 (Bax/Bax)的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用，是启动细胞凋亡的“分子开关”［27-28］。harmine作用胃癌细胞 BGC-823以及 SGC-7901后，bcl-2表达量降低，而 Bax表达量提高。作用肝癌HepG-2细胞后，bcl-2、Mcl-1和bcl-xL的表达量降低，而不影响Bax，这些情况都导致bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax与bclxL/Bax的比值降低［7，17］。因此对 bcl-2家族的影响，既是harmine诱导凋亡效果的重要证据，也可能是主要的机制之一。

2.2.3 p53基因 p53是一个参与细胞应激反应的核转录因子，能对包括DNA损伤与癌基因激活等刺激做出反应。当这些刺激激活p53后，活化的p53激活其靶基因p21、p27、Bax和Bid等，增加细胞色素C的释放，导致caspase-9激活，然后切割效应caspase(如caspase-3)发挥作用继而导致细胞周期阻滞及细胞衰亡［29-30］。p53抑癌基因参与凋亡程序中几乎所有主要步骤，是细胞凋亡与肿瘤发生的关键调控因子。MDM2(Murine double minute 2)是p53的主要调节分子，通过直接相互作用抑制p53的功能。Dai等采用免疫共沉淀法考察了p53与MDM2相互作用，结果表明与p53结合的MDM2表达量随着harmine浓度的增加而大幅降低，内源性p53表达量则被提高，表明harmine对内源性p53与MDM2相互作用的抑制能力呈剂量依赖性。在稳定性实验中，harmine显示出能够保护p53不被蛋白合成抑制剂放线菌酮 (CHX)降解，提升p53稳定性的作用［8］。同时，在B16F-10细胞中harmine还显示出抑制p53及其靶基因mRNA表达的效果［15］。

2.2.4 NF-κB信号通路 NF-κB信号转导通路通常被认为是细胞存活的因素，参与死亡受体途径并能激活 bcl-2、bcl-xL等抗凋亡基因。NF-κB蛋白家族包括一系列转录因子，这些转录因因子在炎症反应、细胞增殖和抗凋亡的信号转导方面起决定性的作用［31-32］。通过酶联免疫吸附法(ELISA实验)测定B16F-10细胞中NF-κB的亚单位p65、p50和c-Rel的表达，研究发现harmine对细胞内p65、p50和c-Rel的表达均表现出一定程度地抑制作用。这种对NF-κB激活抑制的作用可能由harmine对一系列促炎症细胞因子 (TNF-α、IL-1β、IL-6和GM-CSF)的抑制而引起的［15］。

2.2.5 PARP酶 聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一种DNA修复酶。是定位在细胞核内，与应激条件下DNA修复密切相关的一种酶。在体内是caspase-3的主要剪切对象。RARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是caspase-3激活的指标［33］。张晓凯等发现 harmine作用 AsPC-1细胞，显示PARP蛋白表达减少并被切割［22］。Dai等的研究显示 HUVECs中PRAP蛋白的表达的减少、Cleaved PRAP表达量的增多也与harmine呈剂量依赖关系［8］。

2.2.6 核酸酶CAD 细胞凋亡通常伴随着DNA的降解与染色质固缩。除了人们早期研究发现的可以导致DNA断裂的DNase I，DNaseII，DNaseγ以及Cyclophilins等因素以外，研究人员又发现了一种拥有这种活性的分子CAD及其抑制剂 ICAD［34］。CAD(Caspase-activated deoxyribonuclease)是一种能够降解细胞DNA，并使染色质固缩的一类核酸酶。通常情况下，CAD与ICAD以无活性的方式复合物方式存在，而凋亡细胞中活化的caspase-3可以切割CAD并消除其对CAD的抑制效果［35-36］。刘俊玲等研究发现，未药物作用的Jurkat细胞高度表达ICAD，随着harmine药物浓度的增加，ICAD的表达量降低，表明harmine能够通过抑制ICAD，在Jurkat细胞凋亡的信号途径中发挥作用［14］。

2.2.7 细胞周期调控蛋白 细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclins-dependent-kinases)和细胞周期蛋白Cyclins参与细胞周期调控。其复杂的活动与细胞周期的各个环节的紧密相关［37］。作为p53基因的直接靶点，Cyclin A与CDK2结合后激活CDK2，促进细胞由G2期进入M期，G1期进入S期，进而促进了肿瘤细胞的增殖，加速肿瘤的生长侵润及转移。研究表明，细胞外的激酶实验以及在血管内皮细胞HUVES中，CDK2和Cyclin A均受到harmine抑制作用的影响［8］。同时，harmine对其他周期蛋白如 Cdk1、Cdk5、cyclinB1和CDC2也有类似的抑制效果［38］。

3 结语

肿瘤的发生发展是个复杂生理病理现象，随着对细胞凋亡机制研究的逐步深入，人们越来越意识到细胞凋亡信号转导对癌症疾病进程的重要作用。在传统民间用药积累的经验基础上，针对药用植物中有效单体化合物的研究受到广泛重视。骆驼蓬提取物harmine，在多种肿瘤细胞中被确证可以通过诱导凋亡在体内外发挥抗肿瘤活性。而harmine对细胞凋亡信号转导通路上各步骤的关键酶以及重要调控分子的影响，可能是其诱导凋象的分子机制。相信随着对harmine抗肿瘤作用机制研究的不断深入，harmine将会成为癌症化学治疗的一种新选择。

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