Box-Behnken效应面法优化超声提取水蜈蚣多酚工艺

潘 乐，李立青，徐 强

(黄山学院化学化工学院，安徽黄山 245041)

水蜈蚣Kyllinga Brevifolia Rottb，又称金钮草、水金钗、散寒草，是莎草科水蜈蚣属多年生草本植物。《民间常用草药汇编》称其能“散风，除陈寒，止咳嗽”，中医和临床应用研究表明其功能主治为疏风、清热、活血、解毒、发热、百日咳、毒蛇咬伤、风湿性关节炎和跌打损伤等［1-3］，这些功效与水蜈蚣的化学成分密切有关。目前，研究已发现水蜈蚣中存在着挥发油、黄酮类化合物、酚类化合物等化学成分［4-6］。多酚类化合物具备抗氧化、清除自由基、抗癌抗肿瘤、防治心脑血管疾病等特性，是一种重要的生物活性物质［7］。但迄今为止，对水蜈蚣多酚提取的研究仍然较少，仅有贤景春等［6］采用正交设计对乙醇浸提水蜈蚣多酚进行了研究。

由于超声具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，因此超声提取法与传统的热提取法和浸泡提取法相比较，具备提取时间短、操作便捷、产率高、无需加热等优点，已广泛应用于天然植物中多酚的提取［8-9］。考虑到正交设计的局限性，本实验利用Box-Benhnken设计原理［10-11］，采用效应面优化法对超声提取水蜈蚣多酚工艺进行探索，优化和确定了最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 水蜈蚣，购于黄山市徽州医药有限责任公司，由黄山学院生命与环境学院汪立祥副教授鉴定，40℃下烘干12 h，粉碎后置于干燥器中保存;没食子酸对照品，中国食品药品检定研究院，批号110831- 201004;三氯化铁、无水乙醇、铁氰化钾、盐酸等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。

电子分析天平 (梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司);循环水真空泵 (河南巩义市英峪予华仪器厂);KQ-200VDB型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司);UV-2200型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司);JJ-2型小型组织粉碎机 (万州江东机械厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸对照品溶液的配制 准确称取50 mg没食子酸对照品，置于100 mL的棕色量瓶中，加水溶解并定容至100 mL，摇匀。精密量取10 mL置于100 mL棕色量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.05 mg/mL的没食子酸对照品，备用。

1.2.2 没食子酸标准曲线的绘制［12］分别精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL配置好的没食子酸对照品溶液，分别置于6个50 mL量瓶中，每个量瓶中依次加入0.100 mol/L三氯化铁、0.008mol/L铁氰化钾和0.100 mol/L的盐酸溶液各1.00 mL，以水定容至刻度，静置15 min。以未加入没食子酸对照品的样品为试剂空白，在705 nm处测定吸光值，并绘制标准曲线。

1.2.3 样品的提取 精密称取1 g水蜈蚣样品粉末，置于250 mL锥形瓶中。按一定的料液比 (1∶10～1∶35 g/mL)加入不同体积分数的乙醇溶剂 (30%～80%)，超声提取一定时间 (15～40 min)，抽滤得滤液，转移至100 mL量瓶，用同体积分数的乙醇提取剂定容至刻度。精密吸收10 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加水定容，摇匀，即得样品溶液。

1.2.4 多酚的测定 精密量取1 mL样品溶液，按照“1.2.2”项标准曲线测定方法，测定其吸光值。根据标准回归方程得到样品溶液中总多酚的浓度，计算水蜈蚣样品中多酚提取率。

1.2.5 水蜈蚣多酚提取的单因素试验 分别以料液比、提取时间、乙醇体积分数为变量，研究其对水蜈蚣多酚提取率的影响。

1.2.6 效应面对提取工艺的优化 综合单因素试验结果，根据Box-Benhnken设计原理，采用效应面优化法对水蜈蚣多酚工艺进行优化。

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线 按“1.2.2”项的实验方法，测定的标准曲线回归方程为 y=114.6x+0.0177，r2=0.9997，表明方程线性关系良好。

2.2 单因素试验 单因素水平结果如图1～3所示，由图可知，超声提取水蜈蚣多酚各单因素最佳提取条件为提取时间30 min，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶25。

图1 提取时间对提取率的影响

图2 乙醇体积分数对提取率的影响

图3 料液比对提取率的影响

2.3 Box-Behnken实验设计及结果 在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken的设计原理，采用3因素3水平进行效应面分析。每因素设3水平，分别用代码－1、0、1来表示。代码值所代表的实际操作物理量，如表1。

表1 效应面分析因素和水平

按表1的分析因素和水平，利用Design-Expert 8.0.3软件进行实验设计，共设计17个实验点，对每个实验点进行测定，得到实际结果如表2。

表2 效应面实验设计与结果

2.4 模型的建立及分析 利用Design-Expert 8.0.3软件将表2实验数据进行效应面分析:以多酚提取率 (Y)为效应值，分别对乙醇体积分数 (A)，料液比 (B)，提取时间(C)3个因素进行多元回归拟合，发现用二次阶多项式回归最优，软件得到的回归方程如下:

二次多项式回归方程:Y=5.76－0.00625A+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC+0.053BC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9142)

多元线性回归方程:Y=5.37－0.00625A+0.26B+0.15C(r2=0.3504)

比较R2的大小，发现二次多项式回归方程拟合明显优于多元线性拟合，删除其中t检验不显著项，将二项式方程简化为:

Y=5.76+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9841)

对拟合方程进行方差分析见表3。比较表3中各因素的P值可以看出乙醇体积分数、料液比、提取时间3个因素对多酚提取率都有极显著的影响;回归方程失拟检验不显著，说明影响提取的其他一些未知因素对试验干扰较小。因此，该方程较好地描述了总酚提取率随各个因素的变化规律，具备较好的预测指导性。

表3 回归模型方差分析结果

2.5 提取工艺的优化和预测 比较表3中AB、BC、AC这3组交互因素的P值，以AB的相互作用影响最大。利用Design-Expert 8.0.3软件绘制多酚提取率 (Y)与相互作用最显著的两个自变量AB、BC、AC的三维效应曲线面和等高线，如图4～6所示。利用回归模型，对模型方程求一阶偏导可以得到模型的最佳提取条件为:料液比为11∶25.99，提取时间为 30.31min，乙醇体积分数为58.3772%，水蜈蚣多酚的理论提取率为5.81 mg/g。

2.6 验证试验 根据预测的最优提取条件，考虑到实验的方便，将提取最佳条件修正为料液比为11∶26，提取时间为30 min，乙醇体积分数为58%，平行实验3次，多酚提取率分别为5.82、5.79、5.80 mg/g，平均值为5.80 mg/g，RSD为1.72%。表明所建立的数学模型具备精确的预测性，所选的工艺条件具有良好的重复性。

图4 因素AB相互作用对提取率的三维效应曲线面和二维等高线曲线图

图5 因素BC相互作用对提取率的三维效应曲线面和二维等高线曲线图

与文献［6］中乙醇浸提法1.5 h的提取时间相比，超声提取法仅需30 min，耗时明显缩短，单位时间提取次数提高了2倍;同时超声提取法5.80 mg/g的产率相比乙醇浸提法5.09 mg/g的产率，有13.95%的提高。综合考虑单位时间提取次数和提取产率两个因素，超声提取工艺的提取效率明显高于乙醇浸提工艺。

3 结论

图6 因素AC相互作用对提取率的三维效应曲线面和二维等高线曲线图

天然植物中有效成分的提取工艺，较多的是采用正交设计实验，而利用Box-Behnken原理进行方案设计，发挥计算机软件Design-Expert功能强大的特性，可以得到更为精确的数学模型。本实验对影响水蜈蚣多酚超声提取的因素进行了探讨，确立水蜈蚣多酚的超声提取工艺为:料液比为1∶26，提取时间为30 min，乙醇体积分数为58%，提取总多酚产率为5.80 mg/g。由于实验采用了Box-Behnken效应面法进行拟合，充分考虑了各因素之间的相互作用，提高了实验准确性和预测性，能更好地指导工艺。同时与乙醇浸提方法相比，超声提取法在单位时间内的提取次数和提取产率更高。本实验为传统中草药水蜈蚣的超声提取工艺提供了准确的实验数据，有助于水蜈蚣在现代中药产业中的进一步开发和利用。

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