马尾松松针总黄酮的闪式提取研究

杨炳川，方应权

(重庆三峡医药高等专科学校药学系，重庆 404020)

马尾松Pinus massoniana Lamb.为松科Pinaceae植物，是重要的用材树种和荒山造林的先锋树种，也是三峡库区的主要造林树种之一，占库区森林34%，为改善三峡库区生态环境和土壤质量的发挥了重要作用［1-2］。马尾松具有很好的药用价值，松针、松花粉、松节、松香和松黄均可入药［3-4］。马尾松松针 (pine needle)系马尾松的针叶，具有祛风燥湿、解毒止痒、活血安神等功效［3-5］。松针含有挥发油、维生素、莽草素、黄酮类化合物等活性成分［6-7］，其中黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、舒张血管、抗病毒、抗菌和抗过敏等多种药理活性［8］，具有良好的应用前景。

松针总黄酮的提取方法主要有溶剂提取法［6，9］、超声提取法［10］等，乙醇是常用的提取溶剂。传统的提取方法不同程度存在溶剂和能量消耗大、提取时间较长等缺点。闪式提取法是近年来应用日渐广泛的一种中药提取方法，具有快速高效、节能降耗等优点，可以在瞬间完成有效成分的提取，实验型闪式提取器约1～2 min即可完成提取，中试型5～10 min完成提取，相比传统提取方法大大节约了能耗，从而降低生产成本［11-12］。本研究采用闪式提取法提取马尾松松针中的总黄酮，以正交设计优化提取工艺，为高效合理地利用三峡库区马尾松资源提供实验依据。

1 仪器与材料

JHBE-50S型中草药闪式提取器 (实验型，功率1800 W，西安太康生物科技有限公司);RE-5210A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);UV760CRT双光束紫外可见分光光度计 (日本岛津);Sartorius BS110S分析天平 (北京赛多利天平有限公司);松针样品采自长江三峡库区铁峰山，由三峡中药研究所付绍智教授鉴定为马尾松的松针;芦丁对照品 (中国食品药品检定研究院提供，批号110883—200701);所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 闪式提取法提取马尾松松针总黄酮 取马尾松松针烘干 (60℃，12 h)，粉碎，制成粗粉 (20目)，精密称取20 g粗粉置闪式提取罐内，加入12.5倍量 (250 mL)70%乙醇提取110 s，工作电压为120 V。提取液0.8 μm粒径滤膜滤过，滤液备用。

2.2 总黄酮的定量测定和提取得率 根据文献［13-14］，以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮的量。

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品约10 mg，置50 mL量瓶中，加适量70%乙醇，超声使溶解，放置至室温，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得质量浓度约为0.2 mg/mL的芦丁对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“2.1”项下滤液，加70%乙醇至250 mL，精密吸取2 mL至50 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的制备 分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的对照品贮备液至10 mL量瓶，根据文献方法［13-14］，分别依次加入 0.3 mL 5%HNO2溶液、0.3 mL Al(NO3)3溶液和4 mL 4%NaOH溶液，每加入一种溶液后均须摇匀并静置6 min，最后加70%乙醇至刻度，制成质量浓度在0.01～0.05 mg/mL范围的系列对照品溶液 (n=5)，以相应溶剂为空白，在510 nm波长测定吸收度，得回归方程A=0.9037C+0.0826，r=0.9998。其中A为吸光度，C为对照品溶液质量浓度。表明芦丁在0.01～0.05 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度 取1.5 mL对照品贮备液置10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下条件操作，测定吸光度，连续测定6次，其RSD为0.78%(n=6)，说明仪器精密度较好。

2.2.5 重复性 按“2.2.2”项条件制备供试品溶液6份，精密吸取2.5 mL至10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下条件显色，测定总黄酮含有量，其RSD为1.06%(n=6)，说明方法重复性较好。

2.2.6 回收率 精密称取已知总黄酮量的松针粗粉20 g置闪式提取罐内，加入对照品溶液适量，按“2.1”项下方法提取总黄酮，按“2.2.2”和“2.2.5”项下条件测定总黄酮的量，重复操作6次，得总黄酮的回收率为96.27%(n=6)。

2.2.7 稳定性 精密吸取供试品溶液2.5 mL，按“2.2.3”项下条件操作，分别在 0、20、40、60、90、120 min时测定吸光度，RSD为0.76%，说明供试品溶液中120 min内稳定。

2.2.8 马尾松松针提取物总黄酮测定和提取得率 精密吸取供试品溶液2.5 mL至10 mL量瓶，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，代入回归方程计算总黄酮量，并计算提取得率。

2.3 正交试验优化提取工艺

2.3.1 考察因素和水平 考察了影响闪式提取的工艺参数，根据文献［11，15］和预试验结果，本研究确定将松针烘干 (60oC，12h)后制成粗粉 (20目)，以乙醇为提取溶剂，固定工作电压100V。在此基础上，以总黄酮得率为指标，考察影响得率的主要因素，即乙醇体积分数 (A)、液料比 (B)和提取时间 (C)，采用L9(34)正交设计表。考察闪提法工艺，因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.3.2 正交试验 根据正交设计表各因素和水平的安排(表2)进行试验，按“2.1”项下方法提取马尾松松针总黄酮，按“2.2”项下方法测定总黄酮得率，计算极差 (R)，结果见表2。对各因素水平进行方差分析，结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由极差分析可见 (表2)，影响马尾松松针总黄酮得率的因素主次顺序为A＞C＞B，即乙醇体积分数＞提取时间＞液料比。方差分析显示，因素A(乙醇体积分数)和C(提取时间)对考察指标的影响呈统计学显著性意义 (P＜0.05)，因素B(液料比)影响不显著。为使得率最大，选取各因素k值最大时对应的水平，所以，最佳工艺条件应为A3B2C2，即70%乙醇，12.5倍的液料比 (V/m)，闪式提取110 s。

2.3.3 验证试验 按最佳工艺条件提取3份各20 g马尾松松针粗粉，测定吸光度，计算得率。3批供试品的得率分别为3.34%、3.43%和3.32%，平均得率为3.36%，显示此条件提取得率较高，方法重复性好。

2.4 松针总黄酮提取方法比较 取同一批马尾松松针粗粉，以文献报道的方法［9-10］，分别用乙醇回流、超声提取法提取松针总黄酮，每种方法重复3次，与本研究确定的闪提法相比较，结果见表4。

表4 提取方法比较

3 讨论

本研究建立了马尾松松针总黄酮的闪式提取法，用紫外-可见分光光度法测定提取物中总黄酮的量，并计算得率。以总黄酮得率为指标，采用正交设计优化工艺，得到最佳工艺条件为:将马尾松松针烘干后制成粗粉 (20目)，工作电压100 V，以70%的乙醇为提取溶剂，液料比12.5∶1(V/m)，闪式提取时间110 s，提取得率为3.36%，方法简单可靠，重复性好。

用同一批马尾松松针样品，根据文献报道［9-10］的方法，采用乙醇回流法和超声提取法提取总黄酮，测定并计算得率，与本研究所建立的闪式提取法相比较。由于文献中马尾松松针样品前处理方法不尽相同，分别采用了阴干、烘干［9］和新鲜松针直接提取［10］的方法，为方便比较，本研究统一采用烘干 (60℃，12 h)后提取的方法比较各种方法的得率。由表4比较溶剂消耗量，闪式提取法∶乙醇回流法∶超声提取法为1∶2.9∶0.9，即闪式提取法所需溶剂仅为乙醇回流法的约1/3，降低了溶剂用量，这与超声提取法大致相当。比较提取时间，闪式提取法∶乙醇回流法∶超声提取法为1∶300∶30，可见闪式提取法大大缩短了工作时间，并相应的降低了耗电量。从总黄酮的提取得率看，乙醇回流法最高，为3.82%，闪提法和超声法很接近，分别为3.36%和3.48%。

综合来看，闪提法提取马尾松松针总黄酮最大的优势在于缩短提取时间，从而减少能耗;溶剂消耗也少于乙醇回流法，总黄酮得率略低于回流法和超声提取法。因此，闪式提取法可以作为马尾松松针总黄酮的一种提取方法。

［1］雷静品，肖文发，黄志霖，等.三峡库区上游马尾松生长及其与气候变化的关系［J］.华中农业大学学报，2011，30(4):426-431.

［2］葛晓改，肖文发，曾立雄，等.三峡库区不同林龄马尾松土壤养分与酶活性的关系［J］.应用生态学报，2012，23(2):445-451.

［3］李 聪，李 鹏，李志浩，等.马尾松松针的研究概况［J］.国际中医中药杂志，2013，35(8):748-750.

［4］张玉梅，龚庆芳，杨佳倩，等.马尾松中的抗氧化成分［J］.植物分类与资源学报，2013，35(2):209-215.

［5］张海珠，蔡浩玉，刘光明，等.马尾松中重金属的测定［J］.中成药，2013，35(2):576-579.

［6］赵桂芝，寿 旦，俞忠明，等.松针提取物的药理学研究进展［J］.现代医院，2010，10(10):14-16.

［7］谢济云.松针有效成分的提取与分析研究进展［J］.安徽农业科学，2011，39(22):13498-13500.

［8］钟建青，李 波，贾 琦，等.天然黄酮类化合物及其衍生物的构效关系研究进展［J］.药学学报，2011，46(6):622-630.

［9］肖培云，杨永寿，刘光明.云南松松针中总黄酮含量的动态变化［J］.中国医药工业杂志，2012，43(2):97-99.

［10］张卫丽，韩雅莉.响应面法优化马尾松松针中总黄酮提取工艺［J］.广东工业大学学报，2013，30(1):115-159.

［11］方应权.紫花大叶柴胡中柴胡皂苷a的闪式提取工艺研究［J］.中成药，2013，35(12):2614-2616.

［12］谢仲德，李文烈，方应权，等.白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究［J］.中成药，2013，35(9):2037-2039.

［13］刘辉鑫，袁 柯，程存归.红花芒毛苣苔总黄酮提取工艺研究［J］.中成药，2012，34(5):956-958.

［14］马合木提·买买提明，赛力慢·哈得尔，麦得尼亚提·霍加.超声-微波协同萃取芜菁籽中总黄酮提取工艺的研究［J］.中成药，2013，35(2):417-419.

［15］于 敏，韩德强.闪式提取法提取丹参中有效成分的研究［J］.中成药，2010，32(9):1609-1612.