人参中残留有机氯农药在人工胃肠液中的生物有效性

顾 炎，薛 健，常 琪，刘慧灵，刘新民

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

中药材中有机氯农药残留问题受到社会各界的普遍重视，而人参作为重要的中药材，其有机氯农药残留更是备受关注。制定科学的农药残留限量标准，对控制人参质量十分必要。而生物有效性作为人类健康风险评价中的关键因子，其重要性不言而喻。

目前，国际上的胃肠模拟法有十多种，其中比较成熟的有生理原理提取法 (PBET)［1］、荷兰公共卫生与环境国家研究院法 (RIVM)［2］、德国标准研究院法 (DIN)［3］以及人体肠道微生物生态模拟系统法 (SHIME)［4］等等。本实验采用《中国药典》2010年版附录［5］中的配方配制模拟人工胃肠液，对人参药材中有机氯农药在消化道中的生物有效性进行了初步的探究，旨在更好地评价人参中有机氯农药残留对人体的危害性，为其农残标准的制定提供一些建议与参考。

1 仪器与试剂

Agilent(7890型)气相色谱分析仪 (配备电子捕获检测器)、HP-5色谱柱 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美国 Agilent公司)、DB-1701(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)色谱柱 (美国Agilent公司)、PL203/01型电子天平 (瑞士梅特勒)、SK250HP型超声波清洗器 (上海科导仪器有限公司)、LABOROTA4000/4型旋转蒸发器 (德国海道夫)、Feb-80型离心沉淀器 (金坛市医疗仪器厂)、恒温振荡培养箱 (上海岛韩实业有限公司)、SGK-5LB型低噪音空气泵 (北京东方精华苑科技有限公司)。

分析纯丙酮、石油醚、浓硫酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、无水硫酸钠 (北京化工厂);优级纯浓硫酸 (国药集团化学试剂有限公司);1.2万U/g胃蛋白酶、1.3万U/g胰酶 (北京鸿润宝顺科技有限公司);100 mg/L的49种有机氯农药对照品(农业部环保所)，配制成质量浓度为0.05 mg/L的标准溶液。

本实验中所用的人参药材是在众多的测试样品中选出的残留农药种类较多 (8种)、残留量较高的样品，粉碎过筛。

2 方法与结果

2.1 人参样品中有机氯农药本底值测定［6-7］

2.1.1 样品制备 称取人参样品2.0 g于100 mL具塞三角瓶中。加入丙酮-石油醚 (1∶1，V/V)30 mL超声提取15 min，静置，过滤。再用丙酮-石油醚 (1∶1)20 mL提取两次，合并滤液，40℃水浴旋蒸浓缩至近干。将浓缩后的残渣转移至5 mL具塞刻度试管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL浓硫酸，涡旋，离心，取上清液，加入2 mL水洗涤，离心，除去水层，有机层加入少量无水硫酸钠干燥，离心，取上层清液，待测。

2.1.2 仪器分析 实验选用HP-5毛细管柱定量，DB-1701中等极性柱辅助定性。进样口温度250℃，不分流进样。升温程序:初始温度120℃保持1 min，以8℃/min的速度升温至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升温至205℃保持6 min，再以5℃/min的速度升温至270℃，最后以1℃/min的速度升温至280℃，保持5 min。ECD检测器温度:300℃。载气体积流量1 mL/min。尾吹气流60 mL/min。进样量1 μL。外标法定量。

2.2 人工胃液环境中人参中有机氯农药的生物有效性测定

2.2.1 配制人工胃液［5］取稀盐酸3.3 mL，加水约160 mL与胃蛋白酶2 g，摇匀后超声15 min使得所有固体粉末溶解，加水稀释成200 mL，即得。

2.2.2 胃模拟反应 称取2.0 g人参样品于100 mL具塞锥形瓶中 (包锡纸避光)，加入50 mL人工胃液，盖上瓶塞，在37℃恒温震荡培养摇床中以60 r/min振摇3 h后取出，冷却，过滤。

2.2.3 样品处理 将“2.2.2”项中所得滤液依次用100 mL、50 mL石油醚各萃取一次。合并萃取液，40℃旋蒸至近干，将浓缩后的残渣转移至5 mL具塞刻度试管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL浓硫酸，涡旋，离心，取上清液，加入2 mL水洗涤，离心，除去水层，有机层加入少量无水硫酸钠干燥，离心，取上层清液，待测。

2.2.4 仪器分析 分析条件同“2.1.2”项。

2.3 人工肠液环境中人参中有机氯农药的生物有效性测定

2.3.1 配制人工肠液 取1.36 g磷酸二氢钾，加100 mL水溶解，用0.4%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶2 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释成200 mL，即得。

2.3.2 肠模拟反应 称取2.0 g人参样品于100 mL具塞锥形瓶中 (包锡纸避光)，加入50 mL人工肠液，盖上瓶塞，在37℃恒温震荡培养摇床以60 r/min振摇5 h后取出，冷却，过滤。

2.3.3 样品处理 处理方法同“2.2.3”项。

2.3.4 仪器分析 分析条件同“2.1.2”项。

2.4 测定结果

2.4.1 图1为HP-5柱条件下的对照品与人参本底值图谱。

2.4.2 人参样品中有机氯农药本底值及人工胃肠液中有机氯农药溶出量检测，每份样品制备3个平行，测定结果见表1。

2.4.3 通过人工胃肠液中有机氯农药溶出量与人参样品总农残量的比值求得生物有效性值。结果详见表2。

3 讨论

图1 HP-5柱条件下的对照品 (A)与人参本底值 (B)图谱Fig.1 GC(HP-5)of the OCPs in Ginseng

表1 各样品中有机氯农药测定结果 (n=3)Tab.1 Concentration of organochlorine pesticides in each sample(n=3)

表2 人参中的有机氯农药在人工胃肠液中生物有效性Tab.2 Bioavailability of organochlorine pesticides in Ginseng using the simulator of gastrointestinal tract

近年来，体外模拟法由于具有条件可控，稳定性好，易于操作，可用于测试大批量样品，同时还能避免活体实验所带来的伦理问题等优点，越来越多的被应用于生物有效性的测定，在土壤中铅、砷、镉等无机物离子的生物有效性评估方面应用广泛且卓有成效［8］。但有机污染物的测定相对较少，尤其是食物基质中的相关研究更为少见。这是因为有机污染物在人体消化道中的转化过程比较复杂，与有机质含有量丰富的食物一同作为样品测定难度较大。此外，目前不少测定的数据都是添加回收的方法获得的［9-10］，不能准确体现实际污染样品生物有效性的情况。

本实验选取普查过程中获得的有机氯农药残留量较高的人参样品，通过简单的胃肠道消化条件模拟，测定了人参中残留有机氯农药对人体的生物有效性，初步得到以下结果。

首先，从表2中可以看出，对8种检测到的有机氯农药，在小肠环境中的生物有效性数值大多都高于胃环境。六氯苯和五氯硝基苯，在人工肠液中的生物有效性比在人工胃液中的大了接近一倍。个别农药，如β-六六六在两种环境中，有效性数值相差较小。

其次，同一环境中，不同有机氯农药的生物有效性也存在着较大差异。在胃环境中，生物有效性值最大的是氟虫脲 (19%)，生物有效性值最小的是β-六六六 (6.9%)，相差1倍多。而在肠环境中生物有效性最大的则是五氯苯 (25%)，β-六六六的生物有效性值最小 (6.1%)，两者相差接近3倍。由于本实验使用的是自然残留的人参样品，不同种类的农药残留相差较大，浓度差异是否对结果造成影响，还有待于进一步的研究。

最后，在本实验中，无论是肠环境还是胃环境中，有机氯农药对人体的生物有效性都小于30%，最小的只有不到10%，这意味着随着人参进入人体的那部分农药，实际上最终能进入循环系统的只占了总量的一部分。由此可以给相关标准的制定一些提示:生物有效性的数据，对制定科学的限量标准具有一定意义。

本实验中所使用的胃肠模拟配方是最简单的一种，仅考虑了模拟液的pH和酶两个因素，没有考虑胃肠液中的有机物、无机盐以及微生物等因素所带来的影响，今后还应当进一步模拟胃肠条件进行相关研究，并比较不同条件下得出的结果的差异性。另外，体外模拟的实验，最终都需要活体实验加以验证才能确认其正确性，因此，进行活体实验对结果进行确证也是以后需要着重考虑的方向。

［1］Ruby M V，Davis A，Link T E，et al.Development of an in vitro screening test to evaluate the in vivo bioaccessibility of ingested mine-waste lead［J］.Environ Sci Technol，1993，27(13):2870-2877.

［2］Oomen A G，Hack A，Minekus M，et al.Comparison of five in vitro digestion models to study the bioaccessibility of soil contaminants［J］. EnvironSciTechnol， 2002，36(15):3326-3334.

［3］DIN19738-2004，Soil quality-Absorption availability of organic and inorganic pollutants from contaminated soil material［S］.

［4］Laird B D，Van de Wiele T R，Corriveau M C，et al.Gastrointestinal microbes increase arsenic bioaccessibility of ingested mine tailings using the simulator of the human intestinal microbial ecosystem［J］.Environ Sci Technol，2007，41(15):5542-5547.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版二部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅩA.

［6］Hao L，Xue J.Multiresidue analysis of 18 organochlorine pesticides in traditional Chinese medicine［J］.J Chromatogr Sci，2006，44(8):518-522.

［7］薛 健，郝丽丽，田金改，等.党参中29种有机氯农药的多残留分析［J］.药物分析杂志，2008，28(11):1861-1864.

［8］Wragg J，Cave M R.In-vitro methods for the measurement of the oral bioaccessibility of selected metals and metalloids in soils:a critical review［M］.British Geological Survey R＆D Technical Report P5-062/TR/01，Environmental Agency，Bristol，UK，2002:9－10.

［9］陆 敏，余应新，张东平，等.胡萝卜中滴滴涕对人体生物有效性影响因素的体外研究［J］.环境化学，2009，28(2):220-224.

［10］陆 敏，韩姝媛，余应新，等.蔬菜中多溴联苯醚的定量测定及其对人体的生物有效性［J］.分析测试学报，2009，28(1):1-6.