反相HPLC法测定依折麦布片的含量及有关物质

北京万生药业有限责任公司 (101113) 潘海群 耿玉先 范宝成 刘秀梅 张弛

依折麦布(ezetimibe) 由默克（Merck）公司和先灵葆雅（Schering-Plough）公司共同研制[1]，是第一个被FDA批准上市的选择性抑制胆固醇吸收的药物[2]，ezetimibe与现有的调脂药有着完全不同的作用机制,为临床治疗高脂血症等因胆固醇含量高引起的疾病提供了一种新的选择[3][4]，此药用于降低人体胆固醇的含量，对治疗原发性高胆固醇血症，家族性纯合子高胆固醇血症（HoFH），纯合子谷甾醇血症，混合性高脂血症和冠心病都有一定作用[5]。依折麦布的剂型主要是片剂，本文采用反相HPLC测定依折麦布片中依折麦布的含量及其有关物质，该方法简便易行、专属性强、准确度高、稳定性好，可有效控制片剂的质量。

1 仪器和试药

1.1 仪器 高效液相色谱系统:Shimadzu，型号LC-20AT，PDA检测器，日本岛津公司；色谱柱: Hypersil BDS 150mm×4.6mm，5μm，Thermo Fisher Scientific公司；电子天平:Sartorius，型号:BP211D，赛多利斯公司；紫外可见光分光光度仪，型号UV-1800，SHIMADZU公司。

1.2 试药与试剂 供试品：依折麦布片，规格：10mg，批号：21306006、21306007、21306008，北京万生药业有限责任公司；市售品：依折麦布片，规格：10mg，批号：2EZPA11001，先灵葆雅公司。对照品：依折麦布，批号：614401012，Teva API india Ltd.。试剂：乙腈、四氢呋喃为色谱纯 (Honeywell公司)；磷酸二氢钾、冰醋酸为分析纯（天津市光复科技发展有限公司）；纯化水(自制)。

2 方法

2.1 波长验证 取对照品适量，加乙醇制成10μg/ml的溶液，照紫外分光光度法，在200～400nm波长范围内扫描，记录图谱，结果表明最大吸收波长为232nm，故选择232nm作为本品检测波长。

2.2 色谱条件 C18色谱柱：Hypersil BDS(150mm×4.6mm,5um)，流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈-四氢呋喃（65∶25∶10），流速为1.0ml/min，检测波长为232nm，柱温为30℃，进样量为30μl。

2.3 系统适用性试验 称取依折麦布对照品约20mg，置100ml量瓶中，加0.01mol/L乙醇制氢氧化钠溶液10ml使溶解，密塞，于55℃加热15分钟，取出，立即加0.1mol/L盐酸溶液2ml，加水-乙腈-冰醋酸（40∶60∶0.1）适量，放冷，加水-乙腈-冰醋酸（40∶60∶0.1）稀释至刻度，摇匀，即得。照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录ⅤD[6]）测定，精密量取上述溶液30μl注入液相色谱仪，考察主峰与相对保留时间约为1.1处出现的色谱峰的分离度。本色谱条件能将主峰与杂质峰有效分离，依折麦布保留时间为21.5min，主峰的理论塔板数为6987，与RRT1.1的分离度为2.73。

3 专属性

3.1 溶剂、辅料干扰试验考察 溶剂：水-乙腈-冰醋酸（40∶60∶0.1）。

空白辅料溶液：称取依折麦布片空白辅料（约相当于依折麦布10mg），置50ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20分钟，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：溶剂于1.7～3.8min出峰，空白辅料无辅料峰。

供试品溶液：取供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置于50ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20分钟，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取30μl进样，记录色谱图。结果见图1：比较以上图谱可知，溶剂峰均不干扰有关物质的检查，故在有关物质的测定过程中应扣除溶剂。

3.2 破坏试验

酸破坏 称取供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置于50ml量瓶中，加入1mol/L盐酸溶液3ml，于60℃水浴加热1小时后，放冷，再加入1mol/L氢氧化钠溶液3ml中和，按3.1供试品溶液配制方法进行配制。

碱破坏 称取供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置于50ml量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液3ml，于室温下放置30分钟后, 再加入0.1mol/L盐酸溶液3ml中和，按3.1供试品溶液配制方法进行配制。

氧化破坏 称取供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置50ml量瓶中，加入30%过氧化氢溶液3ml, 于60℃水浴加热1小时后，放冷，按3.1供试品溶液配制方法进行配制。

高温破坏 称取供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置于50ml量瓶中，高温105℃放置6小时后，放冷，按3.1供试品溶液配制方法进行配制。

附表 依折麦布片有关物质检查结果

光照破坏 称取经在照度为4500lx±500lx条件下光照24小时后的供试品细粉适量（约相当于依折麦布10mg），置于50ml量瓶中，按3.1供试品溶液配制方法进行配制。

采用高效液相色谱法，取上述续滤液各30μl分别进样，记录色谱图，考察杂质峰与主峰的分离情况。结果见图1图谱中可见溶剂和空白辅料溶液在3.8min之前出峰，对样品测定无干扰；氧化、高温、光照破坏条件下降解杂质较小，各杂质与主峰完全分离，主峰峰纯度合格；在酸、碱破坏条件下降解杂质较大，有明显的降解杂质峰，主峰与各杂质完全分离，主峰峰纯度合格；酸破坏主要产生8.258min、9.741min、35.406min的杂质峰，碱破坏主要产生9.731min和31.666min的杂质峰；在主峰3倍保留时间以后无杂质检出。可见本法可以将依折麦布与有关物质以及可能降解的杂质能完全分离。

3.3 最低检测限 取依折麦布对照品约20mg，置50ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理使溶解，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A；取上述溶液1ml置于100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；取上述溶液1.5ml置于200ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；取30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果主峰峰高约为噪音的3倍，计算此时的依折麦布浓度为0.03μg/ml，即0.9ng，相当于供试品的0.015%，能够有效检测本品的有关物质。

4 有关物质测定

分别取本品（批号21306006、21306007、21306008和市售品）10片，置500ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20分钟，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。另取依折麦布对照品适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含有0.4μg的溶液，作为对照溶液。精密量取对照溶液30μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的10%；再精密量取对照溶液与供试品溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，扣除溶剂峰后，按主成分自身外标法计算最大单杂和总杂质含量，自制三批样品及市售品有关物质检查结果见附表。

结论：三批样品有关物质检查结果表明，其中各杂质均小于0.2%，杂质总量均小于0.5%。

5 含量测定

5.1 线性 量取贮备液A 2.5、4.0、5.0、6.0、7.5ml分别置于10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液；分别取上述溶液30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积与浓度进行线性回归，求得回归方程及线性相关系数，结果本品在98.6～295.9μg/ml范围内具有良好的线性相关性，Y=72.0015X-188.9800，r= 0.9999。5.2 精密度试验

5.2.1 仪器精密度试验 取本品10片，置500ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20min，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液30μl，记录色谱图，重复测定6次，考察主峰面积，峰面积的RSD为0.84%。

5.2.2 方法精密度（重复性）试验 对照品溶液的制备：取依折麦布对照品约10mg，置50ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理使溶解，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取本品10片，置500ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20分钟，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，同法配制6份。取对照品溶液和供试品溶液各30μl进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量，平均值为100.4%、RSD=0.72%。

5.3 溶液稳定性试验 取精密度试验项下的供试品溶液在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12h进样，记录色谱图，结果表明：本品的主峰面积无明显变化，说明依折麦布在溶剂中稳定性较好。计算峰面积的RSD=0.73%。

5.4 回收率试验 供试品溶液的制备：取依折麦布对照品约16mg、20mg和24mg，分别置100ml量瓶中，分别加入空白辅料约220mg，加溶剂适量，超声处理20min使主药溶解，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，分别取续滤液作为80%、100%、120%的供试品溶液，每个浓度平行制备3份。取重复性试验项下的对照品溶液为对照品溶液。

取供试品溶液和对照品溶液各30μl进样，记录色谱图，用外标法以峰面积计算依折麦布的平均回收率和RSD分别为100.3%、0.52%。结果表明：在所选择的测定条件下，方法的准确度较好，空白辅料在主峰位无杂质峰出现，回收率结果良好，辅料也不吸附主成分，测定方法准确可靠。

5.5 含量检测 取本品10片，置500ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理20分钟，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液30μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取依折麦布对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含有0.2mg的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。结果三批样品含量分别为99.6%、100.0%、100.8%，市售品含量为99.9%。

6 讨论

本试验照紫外分光光度法，在200～400nm波长范围内扫描，记录色谱图，其最大吸收波长为232nm。

依折麦布在水中几乎不溶，样品溶液的配制，加水-乙腈-冰醋酸（40:60:0.1)均要超声处理20min，使主药充分溶解，测定准确。

《中国药典》对片剂质量标准的要求，依折麦布片的含量限度应为93.0%～107.0%。实际测得三批样品的含量为99.6%、100.0%、100.8%。三批样品均符合片剂的质量要求。