KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3/5免疫失衡的影响

邓伊++王志强

[摘要] 目的 研究ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖过程的影响，以及细胞因子信号转导抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表达变化与转化生长因子-β1（TGF-β1）分泌释放水平的关系。 方法 体外构建增殖型ASMCs原代培养细胞模型，分为ASMCs组、AngⅡ·ASMCs组、淋巴细胞（L）组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。Real-time PCR检测细胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表达的差异；ELISA法检测上清液中TGF-β1的释放水平。观察KATP通道开放剂尼可地尔（NCR）干预的影响。 结果 与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平明显升高（P<0.01）；NCR作用于细胞后各组ASMCs表达TGF-β1与格列本脲（GLI）比较明显减少（P<0.05）。与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs+L组SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P<0.05）。NCR可以下调SOCS3的表达，上调SOCS5的表达。 结论 KATP通道开放可以通过抑制ASMCs增殖而调控TGF-β1分泌表达；SOCS3和SOCS5可能是哮喘气道重塑的特异性免疫治疗中的重要靶点。

[关键词] KATP通道开放剂；气道平滑肌细胞；细胞因子信号转导抑制因子；哮喘

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（b）-0004-04

细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年来新发现的一类负向调节因子[1]，参与多种细胞因子信号转导过程，其中SOCS3和SOCS5作为SOCS家族的重要成员，可能与哮喘等免疫性疾病的发生、发展有关，并有望成为这类疾病的治疗靶点。有研究说明[2]，ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对哮喘的气道重塑可以产生有益的作用，其机制尚未见系统性的研究报道。本研究利用在体外原代培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP通道开放剂的作用是否与逆转气道平滑肌细胞增殖有关，以及对SOCS3/5免疫失衡的影响，为治疗哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

淋巴细胞分离液，购自碧云天；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司；α-肌动蛋白（α-SMA）单抗，购自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA试剂盒，购自伊莱瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培养基，购自美国Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙据制药股份有限公司；尼可地尔（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro医药公司；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及鉴定 雄性SD大鼠，SPF级，年龄21～36 d，体重100～140 g，由三峡大学实验动物中心提供。方法参考相关文献进行改进[3]。以10%的水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，放入超净台中，开胸取出气管，刮去外膜内膜，D-Hank′s液洗净，剪碎、消化后，用20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，5%CO2培养箱中37℃静置培养1周左右，可见细胞从组织块周围爬出。实验用3～6代细胞，免疫细胞化学染色鉴定平滑肌细胞上特有的α-SMA。

1.2.2 AngⅡ诱导ASMCs的增殖与表达 AngⅡ（100 nmol/L）处理ASMCs，连续作用3 d，24 h换一次液；Western blotting检测α-SMA，评定AngⅡ对ASMCs增殖诱导作用；上清中TGF-β1分泌表达用ELISA检测（按说明书操作），分为ASMCs组和AngⅡ·ASMCs组。

1.2.3 AngⅡ·ASMCs与淋巴细胞共培养 以AngⅡ处理ASMCs后，D-Hank′s液洗3遍，消化重悬，以1×106 cell/L铺于6孔板中，待细胞贴壁生长24 h，加入提取的2 ml T淋巴细胞（1×105 cell/L），作用36 h，分为L组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。

1.2.4 Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5在共培养体系中的表达 ①收集上清中的淋巴细胞，（5～10）×106单个核细胞加Trizol 1 ml，混匀后Trizol法提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA含量。②RT-PCR反应体系：RNA 4.0348 μg，Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ddH2O（RNAse free）至14.5 μl，70℃ 5 min，短暂离心后置于冰上；以上PCR管全部14.5 μl，5×RT缓冲液4 μl，HRP（RRI）/RNAse Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，ddH2O（RNAse free）至20 μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min。③Real-time PCR反应体系：β-actin f（10 μmol/L）0.5 μl，β-actin r（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，Ex Taq 0.25 μl，10×Ex Taq E缓冲液2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O至25 μl，94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30个循环，72℃ 4 min，4℃ 4 min，引物序列及扩增条件见表1。

表1 Real-time PCR反应的引物序列及扩增条件

1.2.5 KATP通道调节剂处理细胞 NCR（开放剂）处理ASMCs以及共培养组细胞，并以DEX（治疗药）和GLI（拮抗剂）分别作为阳性对照和阴性对照。加药后细胞培养36 h，每12小时换一次液。Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5的表达差异；上清中TGF-β1分泌表达用ELISA检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AngⅡ作用于ASMCs的增殖与表达

2.1.1 Western blotting检测α-SMA的表达 BandScan分析胶片灰度值分析后两组α-SMA/β-actin的比较如图1，可见，AngⅡ处理后的ASMCs表达α-SMA水平比未用AngⅡ处理的ASMCs组明显升高，说明AngⅡ处理ASMCs后可使细胞增殖。

图1 AngⅡ处理前后ASMCs增殖的比较

α-SMA/β-actin代表ASMCs增殖量，与ASMCs组比较，*P<0.01

2.1.2 ELISA法检测上清液中TGF-β1表达的差异 与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平明显升高（P<0.01）（图2）。

图2 AngⅡ处理ASMCs前后TGF-β1表达的差异

与ASMCs组比较，*P<0.01

2.2 SOCS3和SOCS5 mRNA在共培养体系中的表达

荧光定量PCR结果采用ΔΔCt法计算：目的基因相对表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=实验组（Ct目的基因-Ct内参基因）-对照组（Ct目的基因-Ct内参基因），所以2-ΔΔCt表示目的基因相对于内参基因的相对表达量。ASMCs与淋巴细胞共培养后，SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P<0.05）；与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs与淋巴细胞共培养，SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P<0.05）（表2）。

表2 SOCS3和SOCS5基因表达相对量2-ΔΔCt值（x±s，n=3）

与L组比较，*P<0.05；与ASMCs+L组比较，#P<0.05

2.3 KATP通道开放剂作用结果

2.3.1 药物作用后上清中的TGF-β1表达差异 在各组用药后DEX和NCR使ASMCs表达TGF-β1水平均比用拮抗剂GLI明显减少（P<0.05）；而AngⅡ处理ASMCs后分泌表达TGF-β1比ASMCs组明显增加（P<0.01）（表3）。

表3 检测上清中的TGF-β1表达差异（x±s，n=3）

与拮抗剂GLI比较，*P<0.05；与ASMCs组比较，#P<0.01

2.3.2 药物作用后SOCS3和SOCS5表达差异 与拮抗剂GLI比较，DEX和NCR作用与共培养体系可以下调SOCS3 mRNA的表达水平，上调SOCS5 mRNA的表达水平（表4）。

3 讨论

支气管哮喘以慢性气道炎症和气道重塑为主要特征，伴随发生气道高反应，而气道重塑的机制和治疗药物是目前研究的热点。支气管平滑肌细胞是支气管主要的结构细胞，其异常增殖在气道重塑中起到十分重要的作用[4-5]。气道平滑肌细胞增生的直接后果是造成气道壁的增厚，加重气道的狭窄，产生气道高反应性，造成呼吸道气流受限，与哮喘严重程度密切相关。因此，有效遏制气道平滑肌细胞过度增殖，是治疗难治性哮喘的根本途径之一[6]。收缩型ASMCs无增殖和迁移能力，对外界刺激产生收缩反应，增殖/合成型能够分泌表达多种活性物质，具有增殖、迁移的能力[7]。本实验采用AngⅡ诱导，在体外建立增殖型ASMCs与淋巴细胞共培养模型，结果显示，ASMCs的增殖可以调节Th1/Th2免疫相关细胞因子信号转导抑制因子的平衡，促进SOCS3的表达而抑制SOCS5的表达，从而使SOCS3/5免疫失衡，表现为SOCS3与炎症反应正相关，而SOCS5则相反。TGF-β1的合成分泌与ASMCs增殖呈正相关，说明TGF-β1可能参与哮喘ASMCs的增殖过程，在哮喘的发病过程中有重要的作用。TGF-β1与气道损伤后的修复过程及气道重塑有密切关系，其在气道中表达增高能刺激气道平滑肌细胞ASMCs分裂与增殖，导致平滑肌增生和肥厚及气道重塑，从而加重哮喘。

钾通道是体内一种重要的离子通道，它广泛分布于各种器官组织的细胞膜，在调节膜电位和兴奋性方面起着重要作用；平滑肌上至少有三种钾通道：钙激活钾通道（KCa）、迟整流钾通道（Kdr）、KATP。其中，KATP最为重要，当该通道开放时，产生一系列电化学反应，有效舒张平滑肌、起到降压解痉的作用[8]，因此，KATP通道是多种疾病的治疗靶点。本实验结果显示，KATP通道开放剂对ASMCs的增殖有抑制作用，相应地TGF-β1也随之减少，与拮抗剂有明显的差异；同时，又可下调SOCS3 mRNA的表达，上调SOCS5 mRNA的表达，从而逆转ASMCs增殖所致的SOCS3/5表达失衡，说明KATP通道开放剂能够抑制气道平滑肌细胞增殖和分泌。

目前认为[9-12]，SOCS通过两条通路抑制信号传导的作用，即JAK激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT），有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶 （MAPK/ERK），但是当前对JAK/STAT通路研究较多，对MAPK/ERK通路研究较少。SOCSs通过细胞内JAK-STAT系统信号途径调节细胞信号转导，参与细胞炎性反应、细胞增殖与分化等生物学功能的调节。已有研究发现，SOCS蛋白对Th细胞的分化具有重要的调控作用[9，13-14]，其中SOCS5/3与Th1/Th2免疫失衡密切相关，SOCS3主要表达在Th2细胞中并抑制Th1型免疫反应，SOCS5通过抑制Th2细胞因子信号转导促进Th1细胞分化[15-17]。因此认为KATP开放剂能够抑制气道平滑肌细胞增殖分泌，并通过调节Th1/Th2免疫因子和SOCS蛋白的免疫平衡产生治疗作用，此方面的研究可望为临床对哮喘的预防和治疗提供新的思路。

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（收稿日期；2014-06-05 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期；2014-06-05 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期；2014-06-05 本文编辑：郭静娟）