调控辅因子水平减少酿酒酵母积累副产物乙醇*

徐国强，陈修来，吴满珍

1(江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

3(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

C4二元羧酸(苹果酸、延胡索酸和琥珀酸等)在食品、医药、材料等行业有着重要的应用价值。2004年，美国能源部专门成立了1，4-二羧酸组，研究苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的生产工艺和应用［1］。以可再生生物质为原料的微生物发酵工艺生产C4二元羧酸的生产工艺具有原料来源广泛、对环境污染小等优势，因而备受各国研究人员的关注。酿酒酵母作为一种真核模式微生物，具有以下优点:(1)营养需求简单、易于培养、下游分离提取工艺低廉;(2)能够耐受较低的pH条件和高浓度的底物产生的渗透压胁迫;(3)长期用于食品、酿造等行业，被美国FDA认证为GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性［2］。因此，酿酒酵母被认为是生产C4二元羧酸的潜在最适微生物。

然而，酿酒酵母本身并不具备过量积累C4二元羧酸的代谢途径，而且在分批发酵中容易生成大量的副产物乙醇。这是酿酒酵母生产C4二元羧酸所面临的两大挑战［3］。酿酒酵母可以分别通过线粒体氧化途径［4］和胞质还原途径［5］来积累 C4二元羧酸，或者同时利用这两种途径来积累目标羧酸［6］。但是，对于以C4二元羧酸为目标产物来说，乙醇的产生导致了碳流的损失。针对这一难题，国外研究者主要采用了两种策略。一是敲除编码乙醇脱氢酶的ADH1-4基因，但这种策略不但没有消除乙醇的产生，还导致了甘油和乙醛的积累。二是敲除丙酮酸脱羧酶的关键基因PDC1，5，6，这种策略可以阻断乙醇的合成代谢，但导致细胞不能在高糖浓度条件下进行分批发酵［7］。荷兰代尔夫特工业大学的Pronk课题组，采用该策略获得的菌株在恒化条件下，通过添加乙酸和乙醇等二碳化合物，可以正常生长，但工艺较为复杂，且发酵周期较长［8－9］。

辅因子(如维生素、NADH等)水平在调控各种生化反应及碳代谢流方面扮演着重要的角色［10］。如图1所示，作为一种重要的辅因子，硫胺素的活性形式是硫胺素二磷酸(ThDP)，而ThDP同为丙酮酸脱羧酶和丙酮酸脱氢酶复合体的辅因子［11］，THI2是硫胺素合成途径中正调控因子［12］。NADH是碳代谢的关键辅因子。通过调控微生物细胞内辅因子的形式和水平，可以定向改变微生物细胞的代谢流。

该研究通过敲除THI2基因，阻断硫胺素的合成途径，并通过外源添加适量的硫胺素二磷酸，弱化丙酮酸的进一步代谢，以达到减少副产物乙醇的目的，在此基础上，通过外源添加NAD+，调控胞内NAD+/NADH比率，进一步促进糖代谢和菌体生长。

图1 酿酒酵母中乙醇合成途径、硫胺酸代谢途径和THI调控机制的相互关系［5］Fig.1 The relationships among the ethanol pathway，thiamine metabolism and THI regulatory system in S.cerevisiae.(a)Thiamine diphosphate(ThDP)in yeast pyruvate metabolism;(b)Schematic outline of thiamine metabolism in yeast;(c)A hypothetical model of the yeast THI regulatory system

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C、敲除用质粒pUG27、标记回收质粒pSH47相关信息见表1。

1.2 培养基

固体培养基:葡萄糖 20 g，Yeast Nitrogen Base(without(NH4)2SO4)1.7 g，(NH4)2SO45 g，加水定容到1 000 mL，pH5.5，琼脂粉 20 g，115 ℃条件下灭菌15 min。倒平板前根据酵母的缺陷营养标记相应加入适量的灭过菌的氨基酸、嘌呤和嘧啶。

种子培养基:酵母粉10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20，用1 000 mL水定容，pH自然，115℃条件下灭菌15 min。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 60，NH4Cl 7，KH2PO45，MgSO4·7H2O 0.8，CaCO340，微量元素10 mL，pH5.0，115℃灭菌20 min，装液量为100 mL/250 mL，ThDP 单独添加，0.04 μmol/L。根据酵母的缺陷营养标记相应加入适量的灭过菌的氨基酸、嘌呤和嘧啶。

微量元素母液:称取 FeSO4·7H2O 2 g，CuSO4·5H2O 0.05 g，MnCl2·4H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 2 g，ZnCl20.5 g，用2 mol/L HCl溶液溶解后定容到1 000 mL，4 ℃保存。

表1 该研究所用的菌株、质粒和引物Table 1 Lists of strains，plasmids and primers used in this study

1.3 培养方法

保藏于甘油管里的酵母菌种经活化后接种到YPD种子培养基，培养至对数生长后期，离心弃上清，用无菌水洗涤1次，按4%的接种量接种到发酵培养基。置入30℃摇床培养，200 r/min，分别于4、8、12 h取样，取样后(此时为对数生长中期)，添加不同浓度的 NAD+(200、1 000、5 000 μg/L)，然后于16、24、36、48、60、72、84、96 h 取样，每次 1.0 mL，其中0.2 mL用于测定生物量(用1.0 mol/L的HCl溶解残留的Ca2CO3)，0.8 mL用于代谢物的检测。

1.4 工程菌株的构建

以质粒 pUG27为模板，利用引物 THI2-F和THI2-R(表1)进行PCR扩增，PCR条件为94℃ 5 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s，72℃ 2 min，29个循环;72℃延伸10 min。获得的PCR产物即为敲除盒，它包含有标记基因kanMX，loxP位点和THI2基因同源的序列。然后利用LiAc转化法将敲除盒直接转化到S.cerevisiae CEN.PK2-1C，涂布在SD(His-)平板上，培养3～5 d。长出的单菌落，接入SD(His-)液体培养基，培养后提取基因组，PCR验证确定为阳性菌落。考虑到进一步的代谢改造需要筛选标记，将用以消除标记的Cre表达质粒pSH47转化到酵母阳性转化子中，切除标记后，并将pSH47移除，最终获得的阳性转化子，将其命名为FMME-002△THI2。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的测定

取0.2 mL混合均匀的发酵液，用0.25 mol/L的HCl除掉发酵液中的CaCO3，并稀释适当的倍数，振荡混匀。待溶液澄清后，以稀HCl为空白，在600 nm波长处测定吸光值，以测得的OD值作为菌体生物量。

1.5.2 代谢物分析

HPLC检测代谢物，葡萄糖、乙醇用RID检测器;色谱柱为 Aminex HPX-87H，流动相为体积分数为0.0275%的H2SO4。

2 结果与讨论

2.1 THI2的敲除对菌株发酵的影响

考察了硫胺素合成缺陷对乙醇形成及菌株发酵特性的影响，结果如表2所示。发酵进行到96 h时，对照菌株FMME-002可积累乙醇5.27±0.23 g/L;相比之下，THI2敲除后，乙醇产量减少到0.53±0.12 g/L。但是，THI2的敲除，导致了菌体生长的减弱，进入稳定期时(24 h)，生物量仅为1.32±0.11，是对照菌株的46.8%;24 h后，FMME-002△THI2几乎停止消耗葡萄糖，发酵进行到96 h时，对照菌株FMME-002已将葡萄糖消耗完，而此时FMME-002△THI2仍有约45.80±0.22 g/L的葡萄糖尚未消耗完。

表2 THI2敲除前后生长及代谢物的比较Table 2 Comparison of growth and metabolite yields of FMME-002 and FMME-002△THI2

在该研究中，THI2基因的敲除，阻断了硫胺素的合成，进而影响了丙酮酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶及α-酮戊二酸脱氢酶的活性。丙酮酸脱氢酶是丙酮酸参与TCA循环的第一个关键酶，而α-酮戊二酸脱氢酶又是TCA循环的关键酶［11］，其活性的下降，会导致TCA循环的减弱，从而影响菌体的生长。此外，ThDP是HMP途径总转酮酶的辅酶，当胞内硫胺素供应不足时，HMP途径代谢受阻，而NADPH又是通过HMP途径代谢产生的，硫胺素的不足会导致NADPH的不足，从而影响到细胞的合成代谢，进而导致葡萄糖的消耗停止［14］。

2.2 VB1的添加对菌株发酵特性的影响

作为一种重要的辅因子，硫胺素在调控菌体生长和代谢中扮演着重要的角色。为了既达到减少乙醇的目的，又对生长和葡萄糖消耗不造成过多的影响，进一步考察了外源添加ThDP对菌体发酵特性的影响，研究结果如图2所示。不添加ThDP时，菌体生物量仅有1.56±0.11，乙醇产量为1.87±0.11 g/L，消耗的葡萄糖为17.32±1.14 g/L。相比之下，添加0.04 μmol/L ThDP时，菌体生物量上升到2.24±0.08，乙醇产量上升到2.56±0.15 g/L，葡萄糖消耗量为24.93±0.63 g/L，较不添加时分别提高了43.6%，36.9%，43.9%。尽管进一步提高 ThDP的添加量，可以进一步促进葡萄糖的消耗和菌体生长，但会导致乙醇的产量提高，违背了减少副产物乙醇的目的。

图2 硫胺素的添加对菌株FMME-002△THI2发酵特性的影响Fig.2 Effect of thiamine on the growth and compound yields of FMME-002△THI2 during aerobic batch growth on 6%glucose

在外源添加 0.04 μmol/L ThDP的条件下，FMME-002△THI2的菌体生长仍然较弱，且仍有较多的残糖不能被消耗。可能的原因有两点:一是硫胺素的不足影响了HMP途径的进行，进而影响了细胞的合成代谢;二是糖酵解产生的NADH不能被进一步氧化，导致胞内NAD+的不足，影响了糖酵解途径的进行，进而导致葡萄糖不能被消耗。糖酵解途径产生的NADH主要通过2种途径被氧化:一是进入TCA循环，将电子传递个分子氧;二是通过丙酮酸脱氢酶旁路代谢，利用底物水平磷酸化将电子传递给乙醛，进而生成乙醇［15］。在该研究中，硫胺素的供应不足同时影响了TCA循环和丙酮酸脱氢酶旁路代谢，因此，可以通过外源增加NAD+的浓度来维持胞内NAD+/NADH的平衡来促进葡萄的消耗。

2.3 NAD+的添加对菌株发酵特性的影响

考察了在发酵进行到12 h外源添加不同浓度的NAD+(200、1 000、5 000 μg/L)对菌体生长、葡萄糖消耗等的影响。研究发现，添加1 000 μg/L NAD+时，对菌体生长、葡萄糖消耗等参数的促进作用最为显著，过多的添加NAD+会导致菌体生长和葡萄糖消耗速率有所下降。以下详细考察了添加1 000 μg/L NAD+对菌株 FMME-002△THI2发酵特性的影响。结果如图3所示，当发酵进行到12 h，添加1 000 μg/L的NAD+能促进菌体的生长，发酵进行到48 h时，生物量为3.12±0.11，较对照提高了47.2%(图3－a);NAD+的添加能明显地促进葡萄糖的消耗，发酵进行到96 h时，葡萄糖消耗量为53.8±1.1 g/L，较对照糖耗(36.2±1.2g/L)提高了48.6%(图3－b);当添加的NAD+的终浓度为1 000 μg/L时，发酵进行到24 h时，乙醇的积累量为3.12±0.2 g/L，较不添加时(2.56±0.15 g/L)仅提高了0.56 g/L(图33－c)。

图3 NAD+的添加对菌株FMME-002△THI2发酵特性的影响Fig.3 Effect of NAD+on the fermentation profile of the strain FMME-002△THI2

通过调控NAD+/NADH能有效地调节微生物细胞的生长及其代谢功能［16］。Liu等［17］在光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸过程添加8 mg/L NAD+合成前体烟酸，使得葡萄糖消耗速率和丙酮酸产量分别提高了48.4%和29%。在该研究中，NAD+的添加有效地促进了葡萄糖的消耗和菌体的生长，同时也没有明显促进乙醇的形成。通过这种策略，达到了在对葡萄糖的消耗及菌体生长影响很小的前提下，实现了减少副产物乙醇的形成的目的。

3 结论

THI2的敲除可以减少乙醇的形成，但极大地影响了葡萄糖的消耗和菌体的生长;外源添加ThDP，可以促进葡萄糖的消耗和菌体的生长，但同时也促进了乙醇的积累;在外源添加少量(0.04 μmol/L)的ThDP 的基础上，添加适量(1 000 μg/L)的 NAD+，可以明显地促进葡萄糖的消耗和菌体的生长，但又不会明显地促进乙醇的积累。因此，通过敲除硫胺素合成途径中的基因THI2，阻断硫胺素的合成，同时外源添加少量的ThDP，并通过添加适量的NAD+，可以实现减少乙醇的目标，但又不影响葡萄糖消耗和菌体的生长，是减少副产物乙醇形成的一个有效的策略。

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