超声-微波协同萃取法提取油菜蜂花粉中黄酮类物质

孙岩，郭庆兴，童群义

1(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

2(百威英博(佛山)啤酒有限公司，广东 佛山，528100)

油菜蜂花粉是工蜂从油菜花蕊内采集的花粉粒，主要成分为蛋白质、多糖、多酚、黄酮、必需氨基酸、维生素［1］等。因富含黄酮类化合物，常具有抗氧化、降血压、降血脂、防治糖尿病和前列腺炎［2－9］等功效。黄酮类化合物种类繁多，目前从油菜蜂花粉中发现的黄酮类化合物有山奈酚、槲皮素、异鼠李素、杨梅黄酮、柚皮素等多种黄酮苷类和苷元。郭娟丽等［10］利用NMR、MS等方法鉴定出油菜蜂花粉含有山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，山奈酚-3，4'-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等9种单体。陈莲君［11］利用NMR鉴定出油菜蜂花粉主要含有3种黄酮类，为山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。而鲁国庆［12］则从油菜蜂花粉残渣中鉴定出了山奈酚、异鼠李素、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。

目前常用的以固体原料来提取黄酮类倾合物的方法主要有热回流法、超声波法、微波法、超临界CO2萃取法［13］。热回流法成本低，操作简便易行，因此最为常用，但存在耗时长、提取效率低的弊端，此外，在提取过程中更多的非目标成分被提取出来，使得后续的分离纯化步骤难度增加［14］。超声法和微波法提取效率相对较高，前者是利用空穴作用破坏植物细胞结构，提高有效成分溶出和扩散，后者则是通过高能作用破坏植物细胞结构，增加有效成分溶出，利用微波电磁场加速扩散，并且不同物质的微波吸收能不同，可实现选择性萃取［15］。超声-微波协同萃取法即是充分结合了超声波及微波的优点，实现了低温常压环境下对固体样品快速、高效、可靠的处理，成本相对超临界CO2萃取也较低。

目前对上述常用方法的研究较多［16－18］，但用超声-微波协同萃取油菜蜂花粉中黄酮类物质的研究少有报道。实验通过单因素实验和正交实验优化了提取工艺，同时与上述几种常用方法进行了比较，并利用LC-MS对制得的黄酮类化合物种类进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油菜蜂花粉(烘干粉碎过100目筛，低温保藏)，江苏省庆缘康生物科技有限公司;芦丁(标准品，≥98%)，阿拉丁试剂有限公司;无水乙醇、石油醚(30℃～60℃)、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH，国药试剂有限公司，分析纯;甲醇、乙腈、甲酸，国药试剂有限公司，色谱纯。

CW-2000超声-微波协同萃取仪(超声波固定频率40 kHz，功率50 W)，上海新拓分析仪器科技有限公司;UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;AB104-N电子天平，Mettler-ToledoInstr(ShangHai)Ltd;FA1004电子天平，上海天平仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司;FW-80-I高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;101－2－BS电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂;液相色谱四级杆飞行时间质谱仪(LC-Q-TOF)，美国Waters公司;Waters 600高效液相色谱仪，Waters公司(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

准确称取2.0 g过筛后的油菜蜂花粉，用滤纸和脱脂棉线包成滤纸包，于索氏抽提器中抽提8 h，除去油脂和色素等杂质，抽提完成后挥干石油醚，低温储藏，备用。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

参照中国药典［16］描述的方法并加以改进测定总黄酮含量。

准确称取芦丁标准品30.00 mg，用无水乙醇溶解，超声10 min使其完全溶解，然后转移入100 mL容量瓶，用无水乙醇定容至刻度线，配制成0.300 0 mg/mL 的芦丁标准溶液。分别取 0、1、2、3、4、5 mL芦丁标准溶液，依次加入0～5号25 mL容量瓶中，并用蒸馏水补足体积到6 mL;加入1 mL质量分数5.0%NaNO2，摇匀，静置6 min;然后加入1 mL质量分数10%Al(NO3)3，摇匀，静置6 min;再加入10 mL质量分数4.0%NaOH，用体积分数50%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min;于510 nm下测定吸光值。以芦丁溶液浓度为横坐标x，吸光值为纵坐标y，绘制标准曲线。标准曲线为:y=11.457 2x－0.002 3，R2=0.999 5。

1.2.3 样品总黄酮含量的测定

将样品液稀释到适宜浓度，然后取1 mL置于25 mL容量瓶，根据1.2.2测定方法，在510 nm下测定样品吸光值。用标准曲线方程计算得出样品液浓度，然后计算总黄酮提取率(以芦丁计，%)。

式中:c为从标准曲线查得的总黄酮浓度，mg/mL;V为提取液总体积，mL;K为提取液稀释倍数;m为原料质量，g。

1.2.4 超声微波协同萃取油菜蜂花粉中黄酮类物质

1.2.4.1 单因素实验

以油菜蜂花粉总黄酮提取率为指标，考察乙醇体积分数(%)、提取时间(s)、液料比(mL∶g)、微波功率(W)4个因素对提取效果的影响，以确定后续正交实验各因素水平。

(1)乙醇体积分数

准确称取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1进行预处后，依照固定液料比20∶1，提取时间180 s，微波功率200 W不变，分别在乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、100%的条件下进行超声微波协同萃取。

(2)提取时间

准确称取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1进行预处后，固定乙醇体积分数90%，液料比20∶1，微波功率200 W 不变，分别在提取时间为 60、120、180、240、360、480 s的条件下进行萃取。

(3)料液比(mL∶g)

准确称取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1进行预处后，固定乙醇体积分数90%，提取时间240 s，微波功率200 W 不变，分别在液料比为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1的条件下进行萃取。

(4)微波功率

准确称取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1进行预处后，依照固定乙醇体积分数90%，提取时间240 s，液料比 30∶1不变，分别在 50、100、200、300、400、500 W的条件下进行萃取。

1.2.4.2 提取工艺优化

根据单因素实验结果，采用L9(34)的正交实验设计，进一步优化油菜蜂花粉黄酮类物质的提取工艺参数。每个实验重复3次。实验因素水平见表1。

表1 正交因素水平设计表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.5 油菜蜂花粉黄酮类物质的LC-MS分析

采用优化的超声-微波协同萃取最佳工艺进行提取，抽滤提取液，然后旋转蒸发浓缩滤液，浓缩液经冷冻干燥制得黄酮粗提物，取适量，用色谱纯甲醇溶解，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，制成澄清透明的液体，供LC-MS分析。

色谱条件:流速0.3 mL/min;进样体积:0.3 μL;检测波长:200～400 nm;色谱柱:Waters Acquity UP-LC BEH Shield RP C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm);柱温:45℃;样品温度20℃;流动相:乙腈/0.1%甲酸，梯度洗脱:0～8 min，乙腈体积分数10%～60%;8～15 min，乙腈体积分数60%～100%。

质谱条件:离子源:ESI电离源;电喷雾离子化负离子采集模式(ESI－);m/z范围:50～1 000;毛细管电压:3.0 kV;锥孔电压:20.0 V;碰撞能量:4.0 eV，离子源温度:100℃;脱溶剂温度:400℃。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与讨论

2.1.1 乙醇体积分数对提取效果的影响

如图1所示，总黄酮提取率随乙醇体积分数的增加而提高。这是因为黄酮类物质是弱极性化合物，易溶于弱极性溶剂。因此，综合考虑选择体积分数90%～95%的乙醇作为后续提取溶剂。

图1 乙醇体积分数对提取效果的影响Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.1.2 时间对提取效果的影响

如图2所示，在240 s以前总黄酮提取率随时间延长而提高，大于240 s后提取率基本不变，在360 s之后略有下降，可能是因为作用时间延长使得提取液温度较高，破坏了黄酮母核的结构。为尽量降低高温对黄酮结构的造成破坏的可能性，尽量选择较的处理短时间。因此，实验选择提取时间240 s。

图2 提取时间对提取效果的影响Fig.2 Influence of extraction times on extraction effect

2.1.3 液料比对提取效果的影响

如图3所示，液料比从10∶1增加到30∶1的过程中，总黄酮提取率显著提高，在料液比达到30∶1之后随着溶剂用量的增加提取率变化平缓。这可能是由于液料比达到30∶1时，总黄酮几乎已经被萃取完全。另外，进一步加大溶剂用量，会增加原料及后续浓缩工艺的成本，因此选用液料比30∶1较合理。

图3 液料比对提取效果的影响Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on extraction effect

2.1.4 微波功率对提取效果的影响

如图4所示，200 W以前总黄酮提取率随微波功率增加而提高，200 W以后随功率增加而下降。由于微波对花粉细胞壁的破碎作用随着功率的增加而逐渐增强，从而有利于黄酮溶出，当达到300 W左右后，提取液温度较高，使得部分黄酮母核结构发生改变，从而降低提取率，因此实验中选取200 W。

图4 微波功率对提取效果的影响Fig.4 Influence of microwave power on extraction effect

2.2 提取工艺优化结果与讨论

极差分析结果表明(见表2)，各因素对提取效果影响大小顺序为A＞C＞D＞B，正交试验结果确定最佳提取条件为A2C3D3B3。方差分析结果表明(见表3)，A、C和D因素的不同水平对总黄酮提取率有显著差异，而B因素在所实验范围内没有显著差异。因此，综合考虑节能，在实验条件范围内，油菜蜂花粉总黄酮最佳提取条件为A2C3D3B1，即乙醇体积分数90%，液料比30∶1，微波功率260 W，时间180 s。

最佳提取工艺确定:分析确定最佳提取工艺A2C3D3B1，即乙醇体积分数90%，液料比30∶1，微波功率260 W，时间180 s。

根据选择的最佳提取条件A2C3D3B1进行实验，计算总黄酮提取率，验证最佳实验条件，实验重复3次。结果表明，在该实验条件下，总黄酮提取率为3.36%，符合正交实验(表2)的结果，因此选择的最佳提取工艺可行。

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 不同提取方法比较

根据正交实验所选最优工艺及陈莲君［11］、杨洁［20］、焦士蓉［21］等报道的热回流、超声法最优提取工艺，确定不同提取方法比较的实验参数，固定乙醇体积分数90%，液料比30∶1不变，其他参数如表4所示。结果表明，超声-微波协同萃取总黄酮得率明显高于超声法和微波法，略高于热回流法，但提取时间明显短于热回流法，在提取效率上具有明显优势。可能是因为超声波的空化作用，加之微波的高能作用，共同促进了乙醇的浸入，加速了黄酮在溶剂中的溶解和扩散，大大减少了提取用时。

表4 不同提取方法的比较Table 4 Comparison of different extraction method

2.4 油菜蜂花粉黄酮类物质的LC-MS分析

黄酮类化合物的结构特点使得其在HPLC条件下具有特征紫外光谱吸收带，图5为超声微波协同萃取得到的油菜蜂花粉黄酮类物质在350 nm下的液相色谱图。

图5 油菜蜂花粉黄酮液相色谱图Fig.5 HPLC diagram of flavonoids extracted fromBrassica napus L.pollen

MS分析对液相色谱图中出现的色谱峰分别进行负离子的1、2级飞行时间质谱研究，得到1、2级质谱图，见图6～图9，其中a、b分别为1、2级质谱图。

化合物1:色谱峰1在4.02 min时的1级质谱给出准分子离子峰［M-H］－625.068 2;2级质谱给出［M-H］－丢失1个葡萄糖的碎片离子峰［(M-H)-162］－463.054 0，及［M-H］－丢失2个葡萄糖的槲皮素苷元的碎片离子峰［(M-2H)－162×2］－299.999 5。

化合物2:色谱峰4.12 min的1级质谱给出准分子离子峰［M-H］－609.065 2，2级质谱给出［M-H］－丢失1个葡萄糖的碎片离子峰［(M-H)－162］－447.056 7，及［M-H］－丢失2个葡萄糖的山奈酚苷元的碎片离子峰［(M-H)－162×2］－285.019 8。

化合物3:色谱峰4.50 min的1级质谱给出准分子离子峰［M-H］－639.088 5，2级质谱给出［M-H］－丢失2个葡萄糖的碎片离子峰［(M-2H)－162×2］－314.023 3，可能是异鼠李素苷元的碎片离子峰。

化合物4:色谱峰4.68 min的1级质谱给出准分子离子峰［M-H］－609.065 2，2级质谱给出［M-H］－丢失2个葡萄糖的碎片离子峰［(M-2H)－162×2］－284.013 6，可能是山奈酚苷元的碎片离子峰。

根据阿布拉江·克依木［22］对黄酮醇O-双糖苷类化合物、黄酮醇二-O糖苷类化合物质谱行为的详细报道和郭娟丽［10］对油菜花粉中醇提组分的结构鉴定结果，结合本实验质谱图所对应的离子峰的质谱信息，推断HPLC分离出的4个主要峰所对应的化合物依次为:槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4'-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

图6 化合物1的质谱图及结构式Fig.6 The mass spectrum andstructural formula of compound 1

图7 化合物2的质谱图及结构式Fig.7 The mass spectrum and structural formula of compound 2

3 结论

通过单因素和正交实验确定超声-微波协同萃取油菜蜂花粉中总黄酮类物质最佳条件:乙醇体积分数90%，液料比(mL∶g)30∶1，微波功率 260 W，时间180 s。该条件下，油菜蜂花粉中总黄酮提取率为3.36%。

不同提取方式的对比实验结果表明，超声-微波协同萃取法提取效率较热回流法、超声法和微波法明显提高，并且降低了高温高压条件导致的萃取物生物活性被破坏的可能。因此，超声-微波协同萃取是一种较为理想的提取方法，具有高效、节能，安全的优点，对油菜蜂花粉黄酮类物质的提取具有一定的应用价值。

图9 化合物4的质谱图及结构式Fig.9 The mass spectrum andstructural formula of compound 4

超声-微波协同萃取得到的油菜蜂花粉黄酮类物质经LC-MS鉴定主要为4种。以液相色谱图和质谱图为依据，参考文献报道分析，推断出这4种化合物可能为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4'-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。准确结构信息，还需要进一步分析和鉴定。

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