糖酯酶促合成及抗真菌活性的初步研究*

赵磊，李思然，张鹤龑，郝添阳，吴迪，王红

(北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心/食品质量与安全北京实验室，北京，100048)

糖酯是糖与脂肪酸发生酯化反应而生成的一类有机成分，以糖(单糖、二糖、多糖、衍生多元醇)作为亲水基团，脂肪酸作为亲油基团，表现出了良好的双亲性，是一种优良的非离子表面活性剂［1］。糖酯因其高度的安全性和良好的表面活性等优点，已相继被世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟、美国、日本和中国等国家和组织批准作为食品添加剂和药用辅料。糖酯可作为食品乳化剂、润湿与分散剂、食品质地改良剂、保鲜杀菌剂、结晶调节剂和抗老化剂，在食品加工中具有广泛用途［2］。其中，糖酯的抗菌功能符合了食品防腐剂抗菌性强、安全无毒、适用性广、性能稳定的发展趋势，在开发营养更全面、更安全的多功能食品添加剂方面具有广阔的前景。

关于糖酯抗菌性的研究有很多［3-10］，日本学者中山等报道，以硬脂酸和棕榈酸为主要组成脂肪酸的蔗糖酯，对罐装咖啡和罐装年糕赤豆汤分离出来的6株平酸腐败菌均有阻碍其增殖作用［3］。Ferrer等发现，6-O-月桂酸蔗糖酯和6’-O-月桂酸麦芽糖酯对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌有抑制作用，而蔗糖月桂酸二酯和6-O-月桂酸葡萄糖酯对微生物则几乎没有抑菌效果［4］。刘巧瑜等报道，0.09%的麦芽糖月桂酸单酯和蔗糖月桂酸单酯可有效地抑制蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长［5］。已有研究表明，蔗糖酯对微生物有广泛的抑制作用，且对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌［6-7］，其作用机理可能与脂肪酸酯破坏微生物的细胞结构，导致细胞内容物流出，或扰乱了与膜相关的呼吸链电子传递系统有关［8-10］。这类具有防腐抗菌作用的非离子表面活性剂几乎不受食品体系pH值的影响，并且安全易降解。然而，现有研究主要针对于各种细菌，有关糖酯抗真菌方面的研究较少，且糖酸组成对糖酯抗真菌活性的影响尚无详细报道。

因此，本研究在查阅有关资料的基础上，以糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖)和脂肪酸(正癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸)为原料，以固定化脂肪酶(Novozym435)为催化剂，在非水相体系中进行合成，产物通过分离纯化，制备得到相应的糖单酯。以草酸青霉、塔宾曲霉、卷枝毛霉及黑根霉4种真菌为供试菌种，进行抗菌活性研究;从而为糖酯在果蔬采后保鲜和食品防腐剂领域的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸购自天津市光复精细化工研究所;D-果糖，购自北京拜尔迪生物技术公司;固定化脂肪酶(Novozym435)，购自丹麦诺维信中国有限公司;PDA培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;柱层析硅胶G(100～200目)、薄层色谱硅胶板G(100mm×200 mm，0.20～0.25 mm)，购自青岛海洋化工厂;草酸青霉(Penicilium oxalicum，GU078430)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis， FJ629356)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides，FN650645)、黑根霉(Rhizopus nigricans)，北京工商大学食品发酵工程教研室惠赠;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HQ45恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂;RV10控制型旋转蒸发器，广州仪科实验室技术有限公司;HSC-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;ZWP-A1230恒温恒湿培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司;Ci-L荧光显微镜，日本尼康株式会社。

1.3 糖酯的制备

采用丙酮作为反应溶剂，糖100 mmol/L，糖酸比1∶3，4 Å 分子筛 70 g/L，脂肪酶(Novozym435)15 g/L，在45℃水浴振荡反应72 h，振荡速度170～180 r/min。反应结束后，过滤除去分子筛、脂肪酶和未反应的糖，上清液旋转蒸发去除溶剂。采用硅胶柱层析方法进行纯化(硅胶G 100～200目，柱12 mm×600 mm)，流动相为乙酸乙酯-甲醇系统，流速为36 mL/h，按1管/5 min收集洗出液，并用TLC检验、收集产物制备得到糖酯(单酯)。

1.4 糖酯抗菌作用的研究

1.4.1 孢子悬液的制备

用无菌接种环轻轻刮取表面的新鲜霉菌孢子至无菌PDA液体培养基中，加入玻璃珠振荡1 h，滤去菌丝体，用血球计数板计数，制成浓度为(0.8～1.2)×106孢子/mL的霉菌孢子悬液，备用。

1.4.2 滤纸片扩散法［11］

按无菌操作的方式，培养皿中倒入10 mL PDA固体培养基，待培养基冷却凝固后，吸取100 μL各类霉菌孢子悬液于培养基表面，用无菌涂布棒涂布均匀。将糖酯溶于无水乙醇中，配制成255 mmol/L的样品溶液。吸取10 μL各样品溶液于直径为6 mm的滤纸片上，待乙醇挥发后，将滤纸片放置在已凝固并涂布有孢子悬液的PDA培养基上，每个处理重复3次，同时做空白对照，在30℃培养箱中培养72 h后观察结果。采用十字交叉法测抑菌圈直径，结果取平均值。通过测定抑菌圈的直径来评价几种糖酯的抗菌作用。

1.4.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定［12-13］

采用孢子悬液点接法测定糖酯的最小抑菌浓度。用倍比稀释法将经过初步筛选有较强抗菌作用的糖酯溶液稀释成各种浓度，各培养皿内加1 mL糖酯溶液和9 mL培养基，充分混匀使糖酯终浓度为0.63～20 mmol/L。待培养基冷却后，于培养皿中央滴入10 μL孢子悬液，每个处理重复3次，同时做空白对照。经以上处理的培养皿放在30℃下培养72 h后观察菌落生长情况，以不长菌的最低浓度为该糖酯的MIC。用十字交叉法测量菌落直径(mm)，计算抑菌率。

1.4.4 不同pH值条件下MIC的测定

首先配制 PDA培养基，用5%柠檬酸和1%NaOH 调整 pH 到 4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0［14］;然后121℃灭菌15 min，冷却;用不同pH的培养基溶解糖酯样品，制备得到不同浓度的糖酯溶液。并按照1.4.3的方法，分别测定不同pH条件下的最小抑菌浓度。

1.4.5 统计分析

所有数据采用Excel软件和SPSS软件(13.0)进行分析，每个实验重复3次，结果以均值±标准偏差(Mean±S.D.)表示。

2 结果与分析

2.1 几种糖酯对供试真菌的抗菌作用

几种糖酯对供试真菌的抗菌作用见表1。由表中可知，几种糖酯对4种供试真菌均具有抗菌作用，对草酸青霉和塔宾曲霉的抗菌作用显著强于其他两种真菌，其抗菌作用强弱顺序为:草酸青霉＞塔宾曲霉＞卷枝毛霉 ≈ 黑根霉。以不同糖癸酸酯为研究对象，比较不同亲水基团(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和果糖)对糖酯抗菌作用的影响。结果表明，果糖作为亲水基团时，对草酸青霉和塔宾曲霉的抗菌作用最好，抑菌圈直径分别为21.2 mm和15.8 mm。因此，选取果糖酯作为后续研究对象，比较不同亲油基团(癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸)对糖酯抗菌作用的影响。结果显示，月桂酸作为亲油基团时，对供试霉菌的抗菌作用最好，对草酸青霉和塔宾曲霉的抑菌圈直径分别达到22.7 mm和18.0 mm。果糖肉豆蔻酸酯和果糖棕榈酸酯对4种供试真菌均无抗菌作用，推测其抗菌作用较差可能与溶解性较差有关。综合分析表1中抗菌作用的结果，选取果糖月桂酸酯，以草酸青霉和塔宾曲霉作为供试菌，进一步进行深入研究。

表1 几种糖酯对供试真菌的抑菌圈直径/mmTable 1 Inhibition zone diameter of several sugar fatty acid esters against tested fungi/mm

2.2 果糖月桂酸酯对供试真菌的抗菌效果及MIC的确定

2.2.1 MIC的确定

果糖月桂酸酯在pH4～8时对供试真菌的MIC，见表2和表3。果糖月桂酸酯对草酸青霉的MIC为1.25 mmol/L(pH5)、10 mmol/L(pH6)、10 mmol/L(pH7)和2.5 mmol/L(pH8);当培养基pH为4时，在所选浓度范围内(0.63～20 mmol/L)，果糖月桂酸酯能够完全抑制草酸青霉的生长。果糖月桂酸酯对塔宾曲霉的 MIC为10 mmol/L(pH5)、10 mmol/L(pH6)、40 mmol/L(pH7)和 5 mmol/L(pH8);当培养基pH为4时，在所选浓度范围内(2.5～40 mmol/L)，果糖月桂酸酯亦能够完全抑制塔宾曲霉的生长。由此看出，果糖月桂酸酯对草酸青霉和塔宾曲霉的抗菌活性有很大差异，草酸青霉对果糖癸酸酯的敏感性较强。此外，抗菌活性受pH值的影响较大，随着pH值的升高呈先降低后升高的趋势。

2.2.2 果糖月桂酸酯对供试真菌的抗菌效果

如表2和表3所示，果糖月桂酸酯除了对供试真菌的菌落直径大小有影响，还影响菌落薄厚和产色素情况。对于草酸青霉，果糖月桂酸酯主要影响其菌落直径，其次是菌落薄厚，而对产色素情况影响不大;通过比较抑菌率，研究pH值对果糖月桂酸酯抗菌活性的影响，发现在中性条件下的抗菌活性低于酸性和碱性条件，其强弱顺序为:pH4＞pH5＞pH8＞pH7＞pH6。果糖月桂酸酯主要影响塔宾曲霉菌落直径和产色素情况，而对其菌落薄厚影响不大;加入果糖月桂酸酯后，塔宾曲霉几乎无黑色素分泌;通过比较抑菌率，研究不同pH值对塔宾曲霉抗菌活性的影响，其强弱顺序依次为:pH4＞pH8＞pH5＞pH6＞pH7。

表2 不同浓度的果糖月桂酸酯对草酸青霉的抗菌效果Table 2 Antifungal effects of fructose monolaurate at different concentrations against Penicilium oxalicum

表3 不同浓度的果糖月桂酸酯对塔宾曲霉的抗菌效果Table 3 Antifungal effects of fructose monolaurate at different concentrations against Aspergillus tubingensis

目前，糖酯作为商品主要是蔗糖与硬脂酸、棕榈酸和油酸的单酯、双酯和三酯以及它们的混合酯。前期研究发现，果糖酯对食品中病原和腐败细菌(如蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等)具有抗菌作用(数据未列出);本研究筛选得到的果糖月桂酸酯对引起食品腐败的真菌(如，草酸青霉和塔宾曲霉)抗菌作用较强，用量为0.05%～1.45%(相当于1.25～40 mmol/L)即可达到抗菌效果。此外，果糖酯在体内可分解为果糖和脂肪酸而被机体利用。果糖在人体中的代谢途径与胰岛素无关，人体适量摄入不会引起血糖及胰岛素水平波动［15］。因此，果糖酯在一定程度上优于蔗糖酯等传统糖酯，将其单独或与其他糖酯配伍使用，可获得兼具乳化和防腐作用的多功能食品添加剂，在食品行业具有广泛的应用前景。

3 结论

本实验以脂肪酶作为催化剂，采用丙酮-分子筛体系进行反应，经硅胶柱层析法分离纯化制备得到了多种糖酯，并评价了它们在不同pH值条件下的抗真菌作用。结果表明，几种糖酯对卷枝毛霉和黑根霉的作用均不明显，但对草酸青霉和塔宾曲霉的抗菌作用较强，其中果糖月桂酸酯的抗菌作用最强。果糖月桂酸酯的抗菌活性受pH值影响较大，随着pH值的升高呈先降低后升高的趋势，在中性条件下的抗菌活性低于酸性和碱性条件。

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