丹参与黄芪配伍干预四氯化碳诱导大鼠肝损害的实验研究

阎小女，王金茹，韩子岩

(1山西医科大学第二临床医学院消化内科，太原 030001;*通讯作者，E－mail:rweiliaoshi@126.com)

肝纤维化［1］是慢性肝病最重要的病理特征，是各种慢性肝病演变成肝硬化的必经病理过程，是肝硬化和肝癌进一步发展的重要环节。目前多数抗肝纤维化治疗仍处在实验研究阶段，临床上缺乏高效、无毒副作用的抗肝纤维化药［2］。传统中药抗肝纤维化方面具有优越性［3，4］，我们前期对我国抗肝纤维化中药做了meta分析，得出众多方剂均以丹参和黄芪作为君药［5，6］。丹参和黄芪药理作用不完全相同，理论上存在互补;两药配伍抗肝纤维化方面报道很少。此外在四氯化碳造模过程中易出现以肝细胞脂肪沉积为特征的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病理改变。故本研究通过动物实验来观察丹参和黄芪对CCl4诱导的大鼠肝脏纤维化以及NAFLD活动度的干预作用。

1 对象和方法

1.1 实验方法

将32只Wistar雄性大鼠，体重(200±20)g，随机分为5组:正常对照组2只，模型组6只，丹参组8只，黄芪组8只，丹参+黄芪组8只。除正常对照组外，余30只大鼠均给予背部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混合液0.3 ml/100 g体重，2次/周，共8周，正常对照组则给予等量的生理盐水。中药剂量按照成人有效剂量(60 kg体重给药30 g)的8倍给药;药物干预组分别给予相应药物灌胃干预持续8周。杀鼠取大鼠肝右叶组织分别行HE染色和Masson染色。

1.2 病理学判定

肝细胞脂肪变、炎症和气球样变参照非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)标准［7］具体如下:脂肪性肝病(NAFLD)评分为NAS(nonalcoholic fatty liver disease activity score):①肝细胞脂肪变:0分，＜5%;1分，5%－33%;2分，34%－66%;3分，＞66%。②小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶):0分，无;1分，＜2个 ;2分，2－4个;3分，＞4个。③肝细胞气球样变:0分，无;1分，少见;2分，多见。NAS(1、2、3项合计)＞4分则可诊断NASH;无小叶内炎症、气球样变和纤维化，但肝脂肪变＞33%者为NAFL，脂肪变达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。

1.3 肝脏胶原纤维测量

应用Image Pro Plus(IPP)6.0专业图像分析软件对Masson染色图片中的胶原纤维进行测量，所选测定指标面积(area)和积分光密度(IOD)。Masson染色的观察:灰色区域主要为胶原纤维。光镜下200倍随机选取3－4个不重叠视野，用Olympus DP 71显微摄像系统拍摄照片，用IPP软件进行胶原纤维定量分析，分析每个组织片上胶原纤维的面积(area)及积分吸光度值(IOD)。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 组织病理结果

2.1.1 肝组织HE染色 正常组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，肝板以中央静脉为中心呈放射状排列，未见脂肪变性、炎症和坏死。模型组可见粗大纤维索、假小叶形成，肝细胞出现脂肪变，部分气球样变，散在少许炎症细胞浸润。与模型组相比，丹参组和黄芪组纤维素纤细，肝细胞脂肪变、炎细胞浸润和气球样变无明显差别。与丹参组和黄芪组相比，丹参+黄芪组肝纤维素数量少更纤细，而肝细胞脂肪变、炎性浸润、气球样变差别不大(图1，见第545页)。

2.1.2 肝组织Masson染色结果 正常组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，未见纤维条索。模型组可见粗大纤维索、多个假小叶形成。与模型组相比，丹参组和黄芪组纤维素数量少且更细，假小叶形成减少。与丹参组和黄芪组相比，丹参+黄芪组肝纤维素数量少更纤细，假小叶形成不明显(图2，见第545页)。

图1 五组8周大鼠肝组织光镜下HE染色结果 (×200)Figure 1 HE staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

图2 五组8周大鼠肝组织光镜下Masson染色结果 (×200)Figure 2 Masson staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

2.2 非酒精性脂肪性肝炎评分(NAS)

模型组、丹参组、黄芪组、丹参+黄芪组四组NAS评分与正常对照组相比均有升高(P＜0.05)，而这四组间两两比较评分差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1 五组大鼠NAS比较结果Table 1 Comparison of NAS among five groups

2.3 胶原纤维的测量结果

模型组的胶原纤维指标面积(area)和积分光密度(IOD)较正常对照组均升高(P＜0.05)，3个药物组的肝纤维面积和IOD值与模型组比较均降低(P＜0.05)，丹参+黄芪组分别与丹参组与黄芪组比较，肝纤维面积和IOD数值均更低(P＜0.05)。但丹参组与黄芪组的面积和IOD比较，差异无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

表2 大鼠肝组织胶原纤维测量值结果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

表2 大鼠肝组织胶原纤维测量值结果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

与正常对照组比较，ΔP＜0.05;与模型组相比，*P＜0.05;与丹参 +黄芪组相比，#P＜0.05

丹参 +黄芪组 22 6.36±1.92* 2.38±1.10*F 103.085 56.505 P＜0.001＜0.001

3 讨论

从20世纪70年代开始国内外学者把中国传统草药作为抗肝纤维化的突破口［8］，目前中药抗肝纤维化已成为国内防治肝纤维化研究的热点，已发现有效的抗纤中草药达50余种［9］，对慢性肝炎、肝纤维化及早期肝硬化，中医治疗多以活血化瘀为主，兼以益气补虚和养血柔肝。我们前期对国内六大抗肝纤维化成方进行meta分析，得出前述六方的交集药味为丹参和黄芪，且丹参和黄芪是抗肝纤维化的有效中草药［5，6］，前期动物实验研究也表明丹参和黄芪治疗肝纤维有效［10］。

本实验丹参组的胶原纤维面积和IOD测量结果较模型组低，说明丹参是有效的抗肝纤维化草药。丹参［11］的有效化学成分主要分为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类，前者包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、丹参甲酯、丹参新酮、二氢丹参酮Ⅰ、次甲丹参酮等，后者主要包括丹参素、原儿茶醛、丹参酸B等。现代药理研究、临床观察及动物实验表明丹参有显著抗肝纤维化作用［12，13］，可抑制HSC的增殖和胶原的合成，促进胶原的降解、改善肝脏内血液微循环、增加肝内源性SOD活性，清除氧自由基，减低肝脏脂质过氧化反应、促进肝细胞的修复、抑制炎症及炎性因子释放起到抗肝纤维化作用。CCl4引起肝纤维化最重要原因是自由基及其脂质过氧化，故抗脂质过氧化损伤可起到抗纤维化并保护肝细胞作用。

本实验黄芪组的胶原纤维面积和IOD测量结果较模型组低，说明黄芪可减轻肝脏内胶原纤维成分沉积，它是有效的抗肝纤药。黄芪［14］化学成分主要包括为多种黄酮类、三萜皂苷类、多糖类、多种氨基酸、维生素和微量元素等。黄芪［14，15］通过增强肝星状细胞间质性胶原酶的基因表达而促进沉积胶原的降解，能抑制成纤维细胞合成细胞外基质(ECM)、降低血清转化生长因子β1、保护肝细胞膜、抗脂质过氧化及抗氧自由基。

本研究还发现丹参+黄芪组胶原纤维表达均少于丹参组和黄芪组，说明丹参和黄芪两药联合抗肝纤维化优于单药的作用，可能与两药抗肝纤维化的不同途径互补有关。但前述两药对非酒精性脂肪性肝炎的活动度(NAS)无影响。关于中药抗肝纤维化深入而准确的机制，需要我们进一步探索;加之中药成分复杂，有效成分的提纯和分析是未来需要深入研究的重点方向。

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