盐酸多西环素注射液最稳定pH值研究

胡海燕，王亦琳，黄耀凌，徐 倩，徐士新，朱馨乐，朱明文

（中国兽医药品监察所，北京100081）

盐酸多西环素（Doxycycline Hydrochloride）为四环素类广谱抗生素，其抗菌活性强于土霉素和四环素，在兽医临床上有广泛应用。但该药结构中含有酚羟基、烯醇基和酰胺基等易氧化水解基团，导致了其在水溶液中的不稳定性质并由此而成为注射液制备的难点。为此，选择适宜的方法阻止或延缓不稳定因素的发生，寻找一个相对稳定的最佳条件是注射液制备的关键，而其中pH值是影响注射液稳定性的重要因素之一。调节适当的pH值可起到延缓药物水解和氧化的作用。目前，农业部颁布的兽药质量标准中，盐酸多西环素注射液的pH值有不同的控制要求［1-2］，这与产品的配方及自身特点有关。不同配方的产品往往因pH值的不同而呈现稳定性的差异。为此，研究探讨pH值与稳定性之间的关系，确定最稳定pH值及其控制范围是注射液研制的重要环节，但目前以化学动力学的方法系统地开展稳定pH值的研究在兽药领域未见报道。本文采用化学动力学方法对所研制的盐酸多西环素注射液进行了稳定pH值研究，探讨和比较了经典恒温法和单测点法的应用，为预测产品稳定pH值及其范围，简化试验方法，提高药物的稳定性和安全性提供理论依据。

1 材料和仪器

1.1 试药 盐酸多西环素（按无水无乙醇物计算，含量97.2%，批号1001803，石家庄华曙善合药业有限公司）；氧化镁（含量98.1%，江苏鹏鹞药业有限公司）；盐酸多西环素对照品（含量85.2%，批号K0131001，中国兽医药品监察所）；土霉素对照品（含量92.4%，批号K0030712，中国兽医药品监察所）；美他环素对照品（含量88.5%，批号30499-200802，中国药品生物制品检定所）；β-多西环素对照品（批号130405-200405，中国药品生物制品检定所）；化学试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，配2487紫外检测器，Waters公司；LHH-150 SD型药品稳定性试验箱，上海一恒科学仪器有限公司；Memmert UM300烘箱，上海Memmert有限公司；EMS-20恒温水浴，常州诺基仪器有限公司；PL202-L电子天平，METTLER TOLEDO 公司；IKA RH basic KT／C磁力搅拌器，IKA公司；FE20酸度计，METTLER TOLEDO公司。

2 方法

2.1 分析方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱phenomenex Luna C18 4.6 mm×250 mm 5 μm；流动相：0.05 mol／L 草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol／L磷酸氢二铵溶液（65∶30 ∶5）用氨试液调节 pH 值至 8.0±0.2；柱温35℃；流速 1.0 mL／L；检测波长 280 nm；进样量20 μL。

2.1.2 系统适用性试验 精密称取土霉素（oxy），美他环素（meta），β-多西环素（beta-Doxy）和盐酸多西环素（Doxy）对照品适量，按文献［2］方法和要求进行试验及判定。结果见表1、图1、图2。

2.1.3 标准曲线 精密称取盐酸多西环素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成浓度为2 mg／mL的标准溶液。精密量取标准溶液用0.01 mol／L的盐酸溶液分别制成浓度为 2.5、5、15、40、80、100、200、400 μg／mL的对照溶液。按2.1.1项下条件测定。以对照溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2.2 供试品的制备 按20%盐酸多西环素注射液的处方量称取盐酸多西环素、氧化镁及其他附加剂，在有机溶剂和注射用水组成的复合溶媒中加热溶解后，降至室温，用盐酸或乙醇胺调节药液至pH 2.0～8.0范围内的不同设定值，过滤，灌装于5 mL棕色西林瓶中，加盖密封，制成系列不同pH值的注射液样品，备用。

2.3 恒温加速试验

2.3.1 经典法 将不同pH值的注射液样品置于若干恒温条件下加速分解，间隔一定时间取样，测得不同时间（t）药物浓度（C）的变化数据，以化学动力学方法进行数据处理，考察加热条件下药物含量与时间的关系，求出各pH样品的速率常数（k），以logk对 pH作图，用图解法及相关参数判定结果。

2.3.1.1 确定反应级数 取pH 3.8的盐酸多西环素注射液样品，分别置40、60、80、90℃四个恒温条件下，于设定的不同时间点间隔取样，按2.1.1项下色谱条件测定，以药物相对百分含量（C%）的对数为纵坐标（y），以时间（t）为横坐标（x）作各温度下样品的logC-t图，考察多西环素含量与热时间关系，拟合线性回归方程，以其图解法进行反应级数的判定。结果表观反应级数基本呈一级反应（表 2、图3）。

2.3.1.2 预测（pH）m 取2.2项配制的7个不同pH值样品，置60℃和80℃恒温条件下考察，于设定的间隔时间点取样测定，以各样品相对百分含量的对数logC（y）对时间t（x）作线性回归，得两个温度下各pH的直线方程，以公式1：k＝-2.303×斜率计算速率常数（k）并与相应的pH值作logk-pH图，进行（pH）m预测。其k值愈小，说明药物分解速度愈慢。pH-速度图（logk-pH图）最低点（最小值）联于横坐标即为最稳定 pH值［3］。结果见表 3～表4、图4～图5。

2.3.2 单测点法 将不同pH值的注射液样品置若干恒温条件下加速分解，在一个设定时间点取样测定药物含量，与考察前测定的初浓度（设定为0时间点）比较，以公式 2：k＝ 2.303／t×logC0／Ct（k 为速率常数，C0为初浓度，Ct为时间t的药物浓度，t为取样时间）计算各pH样品的速率常数，作pH-速度图，以图解法及相关参数判定结果。

2.3.2.1 预测（pH）m 在2.3.1.2项试验中，7个不同pH的样品，在60℃恒温条件下考察，分别取0、7 d各样品的测定数据（表3），根据2.3.2项公式2计算k值，作logk-pH图。结果见表5和图6。

2.3.2.2 预测（pH）m及其范围 选取2.2项配制的不同pH值样品，分组置60℃和80℃条件下考察，于0、10 d取样测定含量，以公式2计算，求出不同pH样品的k值，以logk对pH作图，依据k值和图中显示的最小值区域，确定（pH）m范围。结果见表6、图7。

3 结果

3.1 系统适应性试验 结果（表1、图1、图2）表明：各峰分离度良好，实际理论塔板数符合要求。

表1 系统适用性实验数据

图1 混标（80 μg／mL）溶液色谱图

图2 盐酸多西环素（Doxy）色谱图

3.2 标准曲线 盐酸多西环素线性回归方程为y＝34468x-11410，相关系数为 0.9998 ，在 2.5～400 μg／mL浓度范围内呈良好线性关系。其色谱条件满足产品的测定要求。

3.3 反应级数 由表2和图3可知四个温度下盐酸多西环素的 logC-t为线性关系，R2值均大于0.95，相关性良好。其降解基本呈一级反应。

表2 盐酸多西环素注射液（pH 3.8）不同温度下测定结果及线性关系

3.4 稳定pH值（经典法） 由60℃考察结果表3看出，pH值为4.0时，速率常数k值最小，其次为pH 5.3和pH 3.2，说明在此范围内盐酸多西环素注射液降解缓慢。图4显示pH 4.0时出现极小值，即表明，最稳定pH值为4.0。此外，在pH 8.0处还出现一个相对低点，说明盐酸多西环素注射液在此条件下出现减缓降解趋势。另外表4和图5显示80℃考察的结果与上基本一致，但相同pH条件下的速率常数均大于前者，曲线趋于平缓，表明：随着温度升高，药物的降解反应增大。

图3 pH 3.8盐酸多西环素含量与热时间关系曲线

表3 60℃条件下不同pH值样品的线性方程及速率常数

表4 80℃条件下不同pH值样品的线性方程及速率常数

图4 60℃盐酸多西环素注射液pH-速度图（经典法）

图5 80℃盐酸多西环素注射液pH-速度图（经典法）

3.5 稳定pH值（单侧点法） 从60℃考察的不同pH条件下的速率常数（表5）和pH-速度图（图6）看出，pH 4.0为最稳定pH值，与2.3.1项经典法预测结果相同。

表5 单测点法得到不同pH样品的速率常数

图6 60℃盐酸多西环素注射液pH-速度图（单测点法）

3.6 （pH）m及稳定pH范围 由表6可以看出，pH在2.0～7.0范围内经60℃单测点考察，在pH 3.8和4.2时，k值最小，说明稳定pH值在3.8至4.2之间，其次是pH 4.5和3.5。在此pH范围内80℃考察结果显示pH 4.0时，k值最小。图7直观地显示了两个温度下的趋势线形态，其最小值在4.0，最小值区域在3.0～5.0之间。80℃时的趋势线位于60℃趋势线上方，说明随着温度上升，注射液的不稳定性增大。

表6 盐酸多西环素注射液不同pH值样品高温考察试验结果

4 结论与讨论

4.1 降解反应规律考察 为了解药物降解情况，探讨其降解规律，合理设计实验方案，本文进行了四个不同温度下多西环素浓度的对数与时间的线性关系考察，并对2.3.1.2项试验中7个不同pH值样品在规定［4］要求的高温（60℃）条件下进行盐酸多西环素注射液降解零级、一级和二级反应拟合，结果，在四个高温条件和pH 3.2～8.0范围内基本符合一级反应特征。

图7 盐酸多西环素注射液pH-速度趋势图（单测点法）

4.2 （pH）m及其范围的确定 为了延缓药物降解，需要找出最稳定pH范围。通过60℃和80℃两个恒温条件下的加速试验，以经典法和单侧点法同时考察处理，结合该注射液不同pH值对氧化性和溶解性的影响试验得出：pH值在3.0～4.0时盐酸多西环素溶解度大，抗氧化能力较强；在中性条件下溶解度小，偏碱条件下易氧化变色的结果，综合确定本方法制备的盐酸多西环素注射液最稳定pH值为4.0，注射液pH值控制在3.0～5.0之间，生产pH值控制在3.8～4.2之间。

该注射液对热敏感，生产中要把握关键控制点，严格控制温度和pH值以保证产品质量。

在该pH控制条件下制备的盐酸多西环素注射液经规定的［4］稳定性考察，各项指标符合规定，稳定性良好，有效期两年。

4.3 简化预测方法的探讨 药物稳定性及（pH）m预测的常用方法为恒温加速试验法，即经典法，该方法准确可靠，但工作量大，时间长，数据处理繁琐，试验成本高，为此，出现了一些简化方法的研究和探讨［5-10］。鉴于酸碱度对盐酸多西环素注射液稳定性的重要作用，并为了加快研发速度，探索简化新方法的应用，本研究采用经典恒温法和单侧点法进行了该注射液（pH）m预测，实验表明，两种方法所得结果无明显差异。单测定法简单易行，可与稳定性试验中的高温影响因素试验［4］同时进行，极大减少了工作量和研发成本，明显提高了新产品研发的效率。

4.4 存在的问题及注意点 相对于经典恒温法而言，单侧点法虽然使工作量显著减少，但由于每个温度下只有一个测试点，使精确度有所降低，其措施是增加试验温度数或在一个温度下增加多批次的试验测试，以提高精确度。

因受条件限制，本试验仅选取60℃和80℃两个温度点进行恒温经典法和单侧点法预测，下一步有待于增加试验温度数和批次进行复核试验和相关探讨工作。此外，溶液型制剂（pH）m的控制和调节要在考虑稳定性的同时兼顾溶解度、生理疗效等因素综合制定。

［1］中华人民共和国农业部.兽药国家标准 兽药地方标准上升国家标准（第九册）［S］.

［2］农业部兽药评审中心.兽药国家标准汇编-兽药地方标准上升国家标准（第三册）［S］.

［3］奚念朱，顾学裘.药剂学（第二版）［M］.北京：人民卫生出版社，1980：106-109.

［4］农业部兽药评审中心.兽药研究技术指导原则（药学部分）［S］.

［5］庞贻慧，鲁纯素.药物稳定性预测方法的简化-单侧点法［J］.北京医学院学报，1983，14（3）： 271-273.

［6］庞贻慧，鲁纯素.药物稳定性预测方法的简化-初均速法［J］.药学学报，1983，17（3）：207-211.

［7］李友业.泰乐菌素注射剂稳定性试验［J］.兽药与饲料添加剂（VETERINARY PHARMACEUTICALS ＆FEED ADDITIVES），2000， 5（1）： 13-15.

［8］王 芳.初均速法预测人参茎叶皂苷的稳定性［J］.中国现代应用药学杂志，2007，24（3）：217-218.

［9］王齐放，李三鸣，赵 喆，等.pH及不同缓冲盐对阿莫西林化学稳定性的影响［J］.沈阳药科大学学报，1999，16（3）：176-178.

［10］毛培学，陈 葵，纪利俊，等.硫氰酸红霉素在酸性溶液中的稳定性研究［J］.中国抗生素杂志， 2013， 38（3）： 218-222.