烤烟苗期茎部腐烂病病原菌九州镰孢菌的生物学特性

汪汉成，王进，李文红，陆宁，王茂胜，夏海乾

1烟草行业烟草分子遗传重点实验室,贵州省烟草科学研究院， 贵阳 550081；

2长江大学生命科学学院，荆州 434025；

3贵州省植物保护研究所，贵阳 550006

植物保护

烤烟苗期茎部腐烂病病原菌九州镰孢菌的生物学特性

汪汉成1，王进2，李文红3，陆宁1，王茂胜1，夏海乾1

1烟草行业烟草分子遗传重点实验室,贵州省烟草科学研究院， 贵阳 550081；

2长江大学生命科学学院，荆州 434025；

3贵州省植物保护研究所，贵阳 550006

2012年在烤烟（Nicotiana tabacumL.）苗期发现茎部腐烂病，经病原菌的形态特征观察、rDNA-ITS和EF-1α序列分析，该致病菌被鉴定为九州镰孢菌（Fusarium kyushuense）。该病原菌在利马豆培养基上生长温度范围为5～41℃，最适30℃；分生孢子产生温度范围为10～35℃，最适35℃；分生孢子萌发温度范围为5～42℃，最适20～35℃；分生孢子萌发相对湿度范围为70%～100%，最适100%；可生长pH值为2～11，最适5～7；光照对菌丝生长和分生孢子萌发没有影响，光暗交替培养菌丝生长变慢，但分生孢子产量增加；在供试的95种碳源中，该病原菌能利用葡萄糖、麦芽糖、反丁烯二酸等89种碳源，不能利用N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙酰基-ß-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-丝氨酸和腺苷-5’-磷酸盐6种碳源。

烤烟；九州镰孢菌；生物学特性

随着烤烟（Nicotiana tabacumL.）漂浮育苗技术的推广和应用，烟草苗期病害的发生越来越严重[1]。在高温高湿和烟苗高度集中的连作模式下，病害极易发生而且严重。2012年4月，作者在贵州省烟草科学研究院多年连作的烤烟漂浮育苗大棚中发现了一种烟草茎部腐烂病害。该病害危害严重，其主要症状表现为在烟苗茎基部（尤其与土壤交接处）形成明显的深褐色病斑，被侵染烟株表现出萎蔫、黄化，根系发育受阻等症状；随着病情发展，烟苗最终从发病部位折倒而萎蔫死亡。这些症状同苗期烟草枯萎病、立枯病、黑胫病等根茎病害的症状非常相似。经形态学特征观察、病原菌分离及其rDNA-ITS和EF-1α序列分析，证明该病原菌为九州镰孢菌（Fusarium kyushuense O’Donnell & T.Aoki）[2]。为了解该病害的发生流行规律和有效防治方法，作者对该病菌的生物学特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 病原菌

2012年5月于贵州省烟草科学研究院温室大棚内采集典型发病烟株，按常规方法进行病原菌的分离和纯化[3]，纯化后的菌株保存于利马豆培养（LBA）斜面培养基[4]上，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2 病原菌的形态特征观察

将纯化的病原菌接种到LBA平板上，于25℃黑暗培养，观察菌落形态；7 d后从平板上挑取少量菌丝进行镜检，观察大型分生孢子和小型分生孢子，并观察小型分生孢子的产生方式。

1.3 病原菌的生物学特性研究

1.3.1 温度对菌丝生长、分生孢子形成和萌发的影响

将直径为5 mm的菌苔移至LBA培养基平板（直径9cm）上，分别置于5、10、15、20、25、30℃、35和40℃恒温箱中培养4 d，采用十字交叉法测量菌落的直径。培养6 d时，每培养皿加入10mL灭菌水，滤去菌丝后用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板计测孢子量。每处理设3次重复。

将分生孢子悬浮液稀释成浓度40倍镜下每视野30个孢子，取50 µL涂在凹玻片上，分别置于上述8种温度的恒温培养箱中保湿培养12 h后镜检孢子萌发率。每一重复检查100个孢子，每一处理设3次重复。

1.3.2 pH值对菌丝生长的影响

用 1 mol·L-1HCl或 1 mol·L-1NaOH 将灭菌后的利马豆培养液（LB）分别调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，将直径为5 mm的菌苔分别移入各pH值的LB培养液中，于摇床（30℃，转速180 r·min-1）中培养6 d后，经过滤和菌丝烘干，称其干重。每一处理设3次重复。

1.3.3 光照对菌丝生长、分生孢子形成和萌发的影响

在LBA培养基上接种直径为5 mm的菌苔，分别置于3种不同的光照条件（光照培养箱，光照度100%）下培养：设完全黑暗、12 h光暗交替和完全光照3种处理。在30℃下培养4 d后，测量菌落直径；培养6 d后测量孢子量。每个处理设3次重复。将涂有孢子悬浮液的载玻片分别置于上述3种处理下保湿培养，12 h后镜检孢子萌发率。每一重复检查100个孢子，每一处理设3次重复。

1.3.4 菌丝和分生孢子致死温度的测定

将直径为5 mm的菌苔移至LBA培养基平板上，分别置于40、41、42、43、44和45℃的恒温培养箱中黑暗培养，每处理设3次重复。6 d后观察菌苔是否长出菌丝，确定其致死温度。将分生孢子悬浮液置于大小一致的试管中，每试管5mL，分别放入40、41、42、43、44和45℃的恒温水浴锅中加热20 min。处理过程中随时缓缓摇匀试管，以保证温度均匀。取出后立即在冷水中冷却。采用载玻片萌发法，于30℃黑暗条件下培养24 h，镜检孢子的萌发情况，确定分生孢子的致死温度。

1.3.5 湿度对分生孢子萌发的影响

采用不同浓度的硫酸在密闭干净的干燥箱中调节空气的相对湿度。将孢子悬浮液涂于洁净载玻片上，快速风干后，分别置于相对湿度为50%、60%、70%、80%、90%、100%和100%+水膜 7种湿度条件下，于30℃黑暗条件下培养24 h后镜检孢子萌发率，以水膜中的孢子萌发率为对照。每一处理镜检100个孢子，每一处理设3次重复。

1.3.6 病原菌的碳源代谢特征分析

采用Biolog FF 96孔微孔板进行病原菌的碳源代谢特征分析[5-6]，按照Biolog公司FF的操作指南进行碳代谢测试。收集在LBA平板上培养7天的病原菌的分生孢子，用无菌分生孢子调整FF-IF接种液的浊度为75%T,将菌悬液倒入V型加样水槽中，8通道电动移液器将100 µL菌悬液依次加入微孔板所有孔中，于26℃黑暗培养，96 h后检测病原菌对95种碳源的代谢情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征

病原菌在LBA培养基上生长良好，初为白色菌落，后变为红棕色菌落，气生菌丝放射状生长，25℃黑暗培养4 d菌落直径约为6.5cm；小型分生孢子直或略弯曲，棒状，具0-3个隔膜，7.5～20.0 µm×2.5～5.0 µm；大分生孢子直或略弯曲，细长，具3-5个隔膜，25.0～45.0 µm ×3.3～5.0 µm (图1)。

图1 病原菌的菌落和形态学特征Fig.1 Bacterial colony and morphological characteristics of pathogen

2.2 病原菌的生物学特性

2.2.1 温度对菌丝生长、分生孢子形成和萌发的影响

在LBA培养基上，病原菌的菌丝在5～41℃均可生长，最适温度为30℃，低于10℃或高于35℃时菌落生长明显受到抑制；病原菌在15～25℃易产生红色色素；产生分生孢子的温度范围是10～35℃，最适温度为35℃；在保湿条件下，分生孢子在5～42℃温度范围内均可萌发，在20～35℃萌发率达90%以上（表1）。

菌丝在40℃和41℃培养均能生长，在42～45℃培养均不能生长（表1），因此，该病原菌菌丝的致死温度为42℃。病原菌分生孢子经40～42℃处理20 min后均有少量孢子萌发，经43～45℃处理20 min后均无孢子萌发，因此，该病原菌分子孢子萌发的致死温度为43℃。

表1 温度对九州镰孢菌菌丝生长、分生孢子产量及其萌发的影响Tab.1 Impact of temperature on mycelial growth,conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

2.2.2 pH对菌丝生长的影响

病原菌在pH 2～11范围内均能生长，但中性和偏酸性条件更有利于病菌生长，其最适生长pH范围为5～7 (表2)。从pH4开始，病菌产生红色色素，随着pH升高，菌液颜色逐渐变深且逐渐粘稠。

2.2.3 光照处理对菌丝生长、分生孢子形成及萌发的影响

光照处理对菌丝的生长没有明显的影响。完全光照和完全黑暗条件下菌丝生长速度相近，光暗交替条件下菌丝生长相对较慢（表3）。光暗交替分子孢子产量最高，完全光照和完全黑暗条件下产孢量相近。光照有利于孢子的萌发，但影响不大（表3）。

表2 酸碱度对九州镰孢菌菌丝生长的影响Tab.2 pH effect on mycelial growth of Fusarium kyushuense

表3 不同光照处理对九州镰孢菌菌丝生长、分生孢子形成及其萌发的影响Tab.3 Impact of light on mycelial growth,conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

2.2.4 湿度对分生孢子萌发的影响

在相对湿度100%和黑暗条件下培养24 h，病菌分生孢子的萌发率为100%；相对湿度为70%时分生孢子几乎不能萌发（表4）。表明高湿促进分生孢子萌发，相对湿度100%最适宜分生孢子萌发。

2.2.5 病原菌对碳源利用情况

病原菌经Biolog FF 微孔板培养96 h后的代谢表型如表5所示，病菌可利用较多种类的碳源。在供试95种碳源中，病原菌能够代谢利用的种类有89种，包括各种单糖、多糖和氨基酸类；不能代谢利用种类的有6种，主要有N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙酰基-ß-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-丝氨酸和腺苷-5’-磷酸盐。

表4 不同湿度处理对九州镰孢菌分生孢子萌发的影响Tab.4 Impact of humidity on conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

表5 九州镰孢菌在Biolog FF碳源微孔板上的代谢指纹图谱Tab.5 Metabolic fingerprinting of Fusarium kyushuense on Biolog FF carbon microplate

3 结论与讨论

烤烟苗期茎部腐烂病是近年在贵州烟区苗床上新发现的一种重要病害。作者对引起该病害的病原菌的生物学特性进行了研究，研究结果对该病害的科学防治具有指导意义。

镰孢菌属(Fusarium)是形态变异较大而且最难于鉴定的真菌类群之一。特别是气生菌丝上分生孢子的形态[7]。不同培养条件下的生长特征，如生长速度、色素、寄主类型、致病性、毒素分泌等通常存在一定的差异，这些也是其种分类的辅助依据[8]。

本文报道的九州镰孢菌在其它作物上引起病害的报道却并不多见，仅在日本侵染小麦和在我国侵染水稻稻穗的报道[9-10]。烟草上由镰孢菌属真菌引起的病害主要有枯萎病，病原菌为F.oxysporium f.sp.nicotianae[11]。本文F.kyushuense引起的烤烟苗期茎腐病在国内外尚属首次报道，其有性阶段在本文研究的条件下尚未见到，值得进一步深入研究。

生物学特性测定结果表明，烟草茎腐病菌F.kyushuense是一种适温范围较广的病原菌，在5～40℃均可以生长，最适温度为30℃，在15～25℃易产生红色色素；在10～35℃均可产生分生孢子，最适温度为35℃，且最适20～35℃萌发。这些温度范围与现代设施农艺下烤烟漂浮育苗4～5月的温度基本吻合，大棚室内的高湿环境有利于其侵染与危害。在液体利马豆培养基中，该病原菌在pH2～11范围均可以生长，具有很强的适应性；此外，在供试95种碳源中有89种可以满足该病原菌生长对营养的需求。这些进一步说明该病原菌具有很强的环境生存能力。因此，烟草苗期茎部腐烂病在今后烤烟的漂浮育苗过程中应引起足够的重视，该病害一旦流行将会给烤烟生产造成严重损失。

[1]Jahagirdar S,Hundekar A R.Major diseases of tobacco and their management in Karnataka- A Review [J].Agricultural Reviews,2009,30(3):206-212.

[2]Wang H C,Wang M S,Xia H Q,et al.First report of Fusarium wilt of tobacco caused byFusarium kyushuensein China [J].Plant Disease,2013,97(3):424.

[3]方中达.植病研究方法 [M].北京:中国农业出版社,1998:37,343-345．

[4]Wang H C,Li W H,Chen Q Y,et al.A rapid microbioassay for discovery of antagonistic bacteria forPhytophthora parasiticavar.nicotianae[J].Phytopathology,2012,102:267-271.

[5]Khalil S,Alsanius B W.Utilisation of carbon sources byPythium,PhytophthoraandFusariumspecies as determined by Biolog®microplate assay [J].The Open Microbiology Journal,2009,3:9-14.

[6]Smalla K,Wachtendorf U,Heuer H,et al.Analysis of BIOLOG GN substrate utilization patterns by microbial communities.Applied and Environmental Microbiology,1998,64:1220-1225.

[7]赵志慧,吕国忠,姜子德,等.采用EF-1α序列及气生菌丝上的孢子形态特征对九州镰孢菌、拟枝孢镰孢菌和厚垣镰孢菌的鉴定[J].菌物学报,2011,30(5):713-720.

[8]Seifert K A,Lévesque C A.Phylogeny and molecular diagnosis of mycotoxigenic fungi [J].European Journal of Plant Pathology,2004,110:449-471.

[9]Aoki T,O’Donnell K.Fusarium kyushuensesp.nov.from Japan [J].Mycoscience,1998, 39:1-6.

[10]Zhao Z H,Lu G Z.Fusarium kyushuense,a newly recorded species from China [J].Mycotaxon,2007,102:119-126.

[11]Selvapandiyan A,Mehta A R,Bhatt P N.Cellular breeding approach for development of Fusarium wilt resistant tobacco [J].Proceedings of the Indian National Science Academy,1998,B54 (6):391-394.

Biological characteristics ofFusarium kyushuensecausing tobacco seedling stem rot

WANG Hancheng1,Wang Jin2,LI Wenhong3,Lu Ning1,WANG Maosheng1,XIA Haiqian1
1 Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Academy of Tobacco Sciences,Guiyang 550081,China;
2 College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;
3 Guizhou Institute of Plant Protection,Guiyang 550006,China

Stem rot in flue-cured tobacco(Nicotiana tabacumL.) was observed in tobacco seedlings in 2012.Its pathogen was identi fied asFusarium kyushuenseaccording to morphology,pathogenicity and rDNA-ITS and EF-1α gene analysis.The temperature for the pathogen to grow on LBA ranged from 5℃ to 42℃ with an optimum temperature of 30℃,ranged from 10℃ to 35℃ with optimum temperature of 35℃ ;and ranged from 5℃ to 42℃ with optimum temperature of 30℃ to 35℃for conidial germination.The suitable relative humidity for conidial germination of pathogen ranged from 70% to 100%.The pathogen could grow under pH 2-11 with optimum pH 5-7.Light had no effect on mycelial growth and conidial germination.Light and dark alternation reduced mycelial growth,but enhanced sporulation.Among the 95 carbon resources in Biolog FF Microplate,89 ones could be utilized byF.kyushuense.Carbon resources which could not be used by pathogen include N-acetyl-D-galactosamine,N-acetyl-ß-D-glucosamine,glucuronamide,sebacic acid,L-serine and adenosine-5’-monophosphate.

flue-cured tobacco;Fusarium kyushuense; biological characteristics

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.012

S432.1

A

1004-5708（2014）01-0065-06

国家自然科学基金（31360448）；贵州省科学技术基金（黔科合J字[2011]2337号）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目（201305，201336）

汪汉成（1982—），副研究员，主要从事植保及烟草微生物学研究，Tel:0851-4116941，Email:xiaobaiyang126@hotmail.com

夏海乾（1976—），副研究员，主要从事烟草营养方面的研究，Tel:0851-4116941,Email:xiahaiqian@126.com

2013-04-12