有机负荷对秸秆床反应器厌氧生物产沼气的影响

曹 杰 ,陈广银 ,常志州 *,叶小梅 ,杜 静 (1.南京农业大学资源与环境科学学院,江苏 南京 10095；.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,农业部农村可再生能源开发利用华东科学观测实验站,江苏 南京10014)

有机负荷对秸秆床反应器厌氧生物产沼气的影响

曹 杰1,2,陈广银2,常志州2*,叶小梅2,杜 静2(1.南京农业大学资源与环境科学学院,江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,农业部农村可再生能源开发利用华东科学观测实验站,江苏 南京210014)

在实验室条件下,以打捆麦秸为固定相,以猪场废水为流动相,采用半连续进料方式,考察了不同猪场废水容积负荷对秸秆床反应器产沼气的影响.结果表明:发酵前25d,较高的猪场废水有机负荷对反应器产气有一定抑制,之后日产气量和容积产气量迅速增加,并明显高于低猪场废水有机负荷的处理,当猪场废水容积负荷为 7.2kgCOD/(m3·d)时,厌氧反应器最大容积产气量达 2.29m3/(m3·d),产气稳定后维持在1.52～1.76m3/(m3·d),较猪场废水容积负荷为2.4,1.44kgCOD/(m3·d)的处理分别提高了50%和130%以上,对产气中甲烷含量无明显影响;较高的猪场废水容积负荷不利于麦秸厌氧发酵产沼气,发酵后麦秸干物质损失率、纤维素和半纤维素分解率均与猪场废水容积负荷成反比,红外的结果与之一致.对发酵后麦秸水浸提液的DGGE检测表明,维持反应器高有机负荷、低发酵液HRT,促进了厌氧微生物在麦秸表面定植,微生物种群数量和丰富度均明显高于低有机负荷、高发酵液HRT的处理,反应器耐高有机负荷冲击的能力增强.采用秸秆床反应器处理农村常见的秸秆和畜禽养殖污水产沼气是可行的,且较高的废水有机负荷有利于提高反应器容积产气率.

猪场废水；秸秆床反应器；有机负荷；水力停留时间；沼气

由于养殖废水中含有大量易分解有机物和氮磷营养物,将其与农业秸秆混合厌氧发酵产沼气具有以下优点:避免了秸秆单独发酵需外加水的问题;沼液的产量大幅降低;无需额外添加氮源;提高了厌氧反应器容积产气量.如果将秸秆与养殖废水混合物调节至初始干物质浓度至 10%,则每处理1t秸秆可至少处理7t养殖废水,环境效益明显.畜禽粪便的处理并不困难,可经高温好氧堆肥后还田[1-2],也可与农业秸秆等混合厌氧发酵产沼气[3-5],这方面的研究报道已很多,且已规模化生产,但有关养殖废水与秸秆混合发酵产沼气的研究还不多.由于秸秆流动性差的特点,目前对畜禽养殖废水与秸秆混合厌氧发酵的研究大多停留在批次实验阶段[6-7].

本文以打捆麦秸作为厌氧反应器的固定相,以猪场废水为流动相,研究猪场废水有机负荷和水力停留时间对秸秆床反应器水解产酸和产气的影响,分析了试验过程中水解液COD、pH值、挥发性脂肪酸(VFAs)、产气特性、发酵前后秸秆物质结构和组成以及相关微生物群落的变化,以期为农村废弃物沼气化工程应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

麦秸取自于江苏省农业科学院小麦试验田,风干,人工打成圆柱形捆(高约20cm,直径约18cm,容重为53kg/m3),于干燥阴凉处备用,秸秆干物质(TS)质量为 91.06%,挥发性固体(VS)质量为85.26%,总有机碳含量为 48.78%,总氮为 0.86%,C/N 为 56.72;以猪粪水稀释液模拟猪场废水,猪粪取自江苏省农业科学院六合基地,为新鲜猪粪,TS为 24.50%,总有机碳含量为 45.5%,总氮为3.47%,C/N为13.11,猪场废水浓度根据实验方案配制;接种物为前批次秸秆厌氧发酵后沼液经驯化培养后待用,pH 7.70,TS为1.35%.

1.2 实验方法

实验在总容积 5L的有机玻璃罐内进行.将TS质量265g的打捆麦秸和53g猪粪装入发酵罐,加入接种物将发酵罐内发酵物(麦秸+猪粪)初始TS浓度调节至 10%,密封后于 35℃下进行厌氧发酵实验,实验启动后每天向发酵罐内进入一定量猪场废水,并排出等量发酵液.前期实验发现,猪场废水最大 COD不宜过高,浓度过高导致废水流动性变差,进料困难,且进料后在发酵罐内打捆秸秆的局部堆积,影响后续实验结果.根据前期实验结果,猪场废水 COD最大为 36000mg/L.前期研究发现,当猪场废水 COD负荷提高至7.2kg/m3时,添加了与本实验等量打捆麦秸的厌氧反应器仍可正常运行,故本实验猪场废水最大COD容积负荷定为7.2kg/m3,研究猪场废水不同滞留时间(不同有机负荷)对麦秸产沼气的影响.实验设发酵罐内发酵液停留时间为 1(T1),3(T2),5d(T3),即实验过程中每天排出发酵罐内发酵液总量的100%、33.33%和20%,同时加入等量的猪场废水,排出的发酵液,测定其 COD、pH 值和VFAs.实验过程中,各处理发酵液最大排出量为1000mL,故T1、T2和T3每天发酵液排出量分别为1000,333.33,200mL,对应的T1～T3每天补充的猪场废水容积负荷为 7.20,2.40,1.44kgCOD/(m3·d),每个处理 3个平行,取平均值进行分析.同时,用等量接种物进行厌氧发酵实验,扣除接种物产气对实验结果的影响.实验共进行 50d,每天测定产气量和甲烷含量.

1.3 测定指标及方法

以排水集气法收集气体,每日测定产气量;采用 GC-9890A气相色谱仪分析产气中甲烷含量(TCD检测器);TS的测定采用105℃烘24h,差重法测定;VS的测定采用 550℃灼烧 4h,差重法测定;pH值采用雷磁pHS-2F型酸度计测定;有机碳含量采用重铬酸钾氧化-外加热法[8];全氮采用H2SO4-H2O2消煮,蒸馏定氮法[9];COD 的测定参照 GB1194-89;采用范氏法(Van Soest)测定麦秸纤维素、半纤维素和木质素(FIWE-6,Velp Scientifica)[10];挥发性有机酸(VFA)采用气相色谱仪(GC-2014)进行测定,使用 Stabil-Wax-DA30m×0.53mm×0.25μm 型毛细管柱,FID 检测器,程序升温,以 4-甲基戊酸为内标物;分别取发酵前后的麦秸用蒸馏水清洗干净后冰冻干燥,粉碎,过100目筛后用于测定红外光谱(Nexus 870,美国NICOLET公司)

将发酵后的麦秸用无菌水缓慢洗掉污泥和沼液,取10g鲜样于250mL三角瓶中,加入100mL无菌水,于180rm/min常温下振荡1h,浸提液用于提取DNA.DNA的提取采用FastDNA®Spin soil kit (MP Biomedicals, Solon, OH)试剂盒, 提取方法参照试剂盒说明书,细菌引物为 GC338F(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGACTCC-TACGGGAGGCAG CAG-3′)和 518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′).PCR反应体系都是 50uL,DNA模版 1uL,25umol/L引物各0.5uL,2×PCR mix 25uL,ddH2O 23uL.扩增程序为 94℃(5min)预变性;94℃(1min)变性,56℃(1min)退火;72℃(2min)延伸,33 次循环;72℃(10min).PCR产物通过 DGGE(仪器为D-codeTMSystem(Bio-Rad))进行分离,聚丙烯酰胺凝胶浓度为 8%,变性梯度为 45%～65%,85V,1×TAE中电泳16h,胶用银染法染色成像.

DGGE电泳图谱采用Bio-Rad Quantity One 4.6.3 软件对各样品条带多少及密度进行定量分析,以作为多样性统计指标的初步数据.采用Shannon-Wiener指数(H′),[H′ = -ΣPi × lnPi( Pi表示每个种群在群落中的百分比)]、优势度指数[D,D=Σ(pi)2]、丰度(S)、均匀度指数( E,E = H/lnS)等指标比较各个样品的多样性.DGGE条带图谱相似性聚类分析,由系统软件依据戴斯系数 Cs(Dice coefficient)按照UPGMA算法计算绘出.

2 结果与讨论

2.1 实验过程中各处理产气特性的变化

由图 1可以看出,各处理日产气量变化趋势相似,均为在实验前期缓慢增加,T1、T2、T3日产气量分别在实验第34,33,33d达到最大值,分别为 11425,7015,6325mL,对应的容积产气量分别为 2.29,1.40,1.27m3/(m3·d),之后 T1、T2 和 T3 分别稳定在 7600～8800,4800～5400,3000～3800mL,对应的容积产气量分别为 1.52～1.76, 0.96～1.08,0.6～0.76m3/(m3·d),T1 的容积产气量较 T2、T3 分别高出 50%和 130%以上.实验启动初期,由于反应器内发酵底物浓度较高(该阶段麦秸的水解产酸能力较强以及每天添加的猪场废水),产甲烷微生物受发酵液出料的影响较大,较高的容积负荷(较低的pH值)也不利于甲烷菌繁殖,结果出现猪场废水HRT越短、反应器容积负荷越高,日产气量越低的结果.随着实验的进行,麦秸的水解产酸能力逐渐减弱,加之大量厌氧微生物在麦秸表面定植,系统对高容积负荷冲击的耐受力增加,日产气量逐渐增加,且日产气量与猪场废水容积负荷成正比.实验35d后,麦秸自身水解产酸的能力已经很弱(麦秸批次实验发酵周期一般为40～45d,30d后日产气量已很低),其对系统有机负荷的贡献很小,发酵液 COD主要来自每日添加的猪场废水,故出现日产气量T1>>T2>T3的结果.实验前 25d,T3的日产气量明显大于 T1、T2,在实验第5d～23d,T2的日产气量稍高于T1,这与麦秸单独厌氧发酵时 80%的产气集中在发酵前25d的结果一致[11],表明秸秆床反应器应采用低有机负荷启动的方式,发酵初期由于麦秸自身的水解产酸能力较强,添加较高浓度的外源有机物对系统产气产生抑制,不利于秸秆床反应器快速启动.实验第 25d后,T1的日产气量迅速增加,增加速度和幅度均明显高于T2和T3,表明秸秆床反应器对高负荷猪场废水具有较强的耐受力.

图1 厌氧发酵过程中各处理日产气量的变化Fig.1 Daily biogas yield of different treatments during the experiment

由图 2可以看出,各处理甲烷含量的变化趋势相似,均为先增加后降低,达到最低点后迅速回升,之后逐步达到稳定.实验启动后,各处理产气中甲烷含量迅速增加,T1、T2、T3均在实验第5d产气中甲烷含量达到第一个高峰,分别为51.34%、43.68%和46.44%.由于麦秸有机物的大量水解溶出以及每天添加的猪场废水,加上实验初期甲烷菌数量还不够丰富,有机物的大量水解产酸对甲烷菌产生抑制,各处理产气中甲烷含量下降,但随着实验的进行,系统中产烷菌的大量繁殖以及甲烷菌在麦秸表面的大量定植,甲烷菌对小分子有机酸的利用能力不断提高,产气中甲烷含量迅速增加,当系统中甲烷菌数量达到相对稳定后,其对小分子有机酸的利用速率与麦秸和猪场废水有机物水解产酸速率间相对平衡,产气中甲烷含量相对稳定,在 60%左右波动,T1产气中甲烷含量略低于 T2、T3,这与其较高的有机负荷、较低的HRT有关,高负荷导致有机酸等含量相应较高,pH值较低,对产甲烷菌有一定抑制作用,低 HRT可能带入更多的分子氧,从而抑制甲烷菌活性,降低产气中甲烷含量.40d后各处理产气中甲烷含量均缓慢降低,最后稳定在60%～70%之间,且T1甲烷含量高于T2、T3,T2、T3相近,具体原因还有待于进一步研究.

图2 各处理产气中甲烷含量的变化Fig.2 Changes of methane content of different treatments during the experiment

2.2 实验过程中各处理发酵液理化特性的变化

2.2.1 发酵液 COD 的变化 本实验中,由于采取每天进猪场废水,同时排出等量发酵液的方式,当排出的发酵液 COD、被厌氧微生物转化为沼气的COD和被厌氧微生物用于自身繁殖代谢的COD之和小于麦秸、猪粪水解溶出的COD和每天补充的猪场废水COD之和时,发酵液COD增加,反之降低.由图 3.可以看出,各处理发酵液COD变化趋势相似,均为先迅速增加后缓慢降低.实验启动后,随着麦秸有机物的水解溶出以及猪场废水的不断添加,各处理发酵液 COD不断增加,表明该阶段麦秸有机物水解溶出作用较强,T1、T2、T3分别在实验第11,6,3d达到峰值,分别为56420,40810,35200mg/L.随着实验的进行,麦秸中大部分易分解有机物已水解溶出,可分解有机物和难分解有机物水解溶出较慢,相应的反应器日产气量逐步增加,COD增加速度低于COD消耗速度,发酵液COD逐渐降低.实验过程中,各处理发酵液 COD与外加的猪场废水负荷成正比.对比各处理产气的结果可以看出,实验前25d,发酵液较高的COD不利于系统产沼气,之后发酵液 COD与产气的结果一致,再次说明秸秆床反应器由于秸秆自身水解产酸的影响应采取低负荷启动的方式.

图3 实验过程中发酵液COD的变化Fig.3 Changes of COD content of different treatments during the experiment

2.2.2 发酵液TVFAs的变化 由图4可以看出,各处理TVFAs的变化趋势相似,均为先迅速增加,后迅速降低,达到一定浓度后缓慢下降.T1、T2、T3均在实验第 6d达到最大,分别为 7865.87,9918.61,8226.04mg/L,之后迅速降低,20d后维持在较低水平,各处理间并无明显差异.从本实验TVFAs的结果看,发酵液中TVFAs主要来自麦秸水解产酸,猪场废水对 VFAs的贡献较低,这与吕利利等[12]研究结果一致.

图4 厌氧发酵过程中各处理发酵液TVFAs的变化Fig.4 Changes of TVFAs content of different treatments during the experiment

2.2.3 发酵液pH值的变化 由图5可以看出,各处理 pH值变化趋势相似,均为先降低后缓慢增加,最后达到相对稳定,这与各处理 TVFAs的结果一致.T1、T2、T3均在实验室第5d达到最低值,分别为6.08、6.10和6.31,之后逐步回升并达到相对稳定,T1稳定在7.4左右,T2、T3稳定在7.6～7.8之间.

2.3 厌氧发酵前后各处理麦秸理化特性和物质组成的变化

图5 实验过程中各处理发酵液pH值的变化Fig.5 Changes of pH values of different treatments during the experiment

2.3.1 厌氧发酵前后麦秸理化特性的变化 由表1可以看出,经50d厌氧发酵后,各处理麦秸干物质质量均大幅降低,T1、T2、T3分别降低了45.33%、50.58%、52.83%,麦秸 TS损失率随着猪场废水有机负荷的增加而降低,这可能是因为:本实验采取半连续进料方式,微生物在有大量易分解有机物存在的情况下首先利用易分解有机物,造成猪场废水有机负荷越高的处理麦秸降解率越低的结果.

表1 厌氧发酵前后麦秸理化特性的变化Table 1 Physico-chemical properties of wheat straw before and after anaerobic digestion

麦秸厌氧发酵过程中,厌氧微生物分解利用的主要有机物是纤维素和半纤维素,木质素在厌氧发酵过程中几乎不能被厌氧微生物分解[13].厌氧发酵后,各处理麦秸中半纤维素和纤维素含量均降低,木质素含量相对增加,T1、T2、T3半纤维素和纤维素含量分别降低了 18.19%,21.36%,25.62%和 11.45%,9.09%,13.54%,木质素含量增加了 40.55%,34.47%,40.71%,各处理间无明显差异(P>0.05),这与 TS损失率的结果一致.同时,可以看出,在本实验条件下,麦秸中半纤维素被分解利用的程度高于纤维素.

2.3.2 厌氧发酵前后麦秸FTIR分析 由图6可以看出,各处理厌氧发酵前后红外光谱谱图相似,只是在某些吸收峰的吸收强度上不同,表明厌氧发酵并不能破坏麦秸的骨架结构,只是某些官能团的含量发生了变化.厌氧发酵后在 2920cm-1吸收峰强度增强,在 2852cm-1处的吸收峰从无到有,吸收峰强度均为 T2>T3>T1>发酵前,表明厌氧发酵后麦秸中脂族结构中亚甲基C—H的伸缩振动和—CH3官能团的C—H伸缩振动增强[14].

图6 发酵前后麦秸的红外光谱变化Fig.6 FT-IR spectra patterns of wheat straw obtained before and after anaerobic digestion

图7 发酵前后麦秸红外光谱指纹区的变化Fig.7 Fingerprint region of FTIR spectra of wheat straw obtained before and after anaerobic digestion

由图 7可以看出,厌氧发酵后一些吸收峰的强度发生了明显变化,在 1733,1512, 1462,1426,1375,1254,1162,895cm-1处吸收峰强度明显降低,降低幅度均为 T3>T2>T1,T3在 1375, 1254,895cm-1处的吸收峰几乎消失,在 1651cm-1处吸收峰强度增加,1733cm-1处是半纤维素中未键和的C=O伸缩振动,1651cm-1处是O—H和共振C—O振动,1512cm-1处是木质素中苯环的股价伸缩振动,1462和1426cm-1处是木质素和碳水化合物中 C—H的弯曲振动,1375cm-1处是纤维素和半纤维素中 C—H的变形振动,1254cm-1处是木质素中紫丁香基芳香环和 C—O的伸缩振动,1162cm-1处是纤维素和半纤维素中C—O—C的振动,895cm-1处纤维素中C—H的弯曲振动[14-15].红外的结果表明,厌氧发酵后,各处理麦秸的物质结构破坏严重,T3的官能团破坏程度最大,这与产气的结果一致.

2.4 厌氧发酵后麦秸水浸提液细菌DGGE分析

图8 厌氧发酵后麦秸水浸提液细菌DGGE谱图Fig.8 DGGE profile of bacteria produced from water extract of digested wheat straw

从图8可见,各处理麦秸水浸提液DGGE谱图条带分布总体相似,但条带数量和深浅有一定差异.从条带数量看,T1和 T2均有较清晰的 11个条带,T3可清晰辨别的条带仅为1、3、4、5、6和7等6个条带,条带数量大幅减少,不同有机负荷和不同HRT处理后,富集在麦秸表面的微生物种类存在较大差异.从条带深浅看,T1～T3在各条带的颜色深浅均为递减趋势.从各处理麦秸水浸提液 DGGE谱图的结果看,高有机负荷和低HRT促进了微生物在麦秸上的定植,微生物种群结构和数量均明显高于低有机负荷和长HRT处理的麦秸,这可能是高有机负荷、低发酵液HRT下厌氧反应器仍可正常产气的重要原因.

从表2的结果看,T1～T3丰度和多样性指数均成递减趋势,优势度指数成递增趋势,均匀度指数无明显差异,表明高有机负荷和低HRT环境均有利于微生物的定植,微生物丰度和多样性均较高,但微生物中优势种集中程度稍有降低,对微生物均匀度的影响不大.

表2 不同处理细菌丰度(S)、多样性指数(H′)、优势度指数(D)、均匀度指数(E)Table 2 Indices for richness (S), diversity (H′), dominance(D)and eveness (E)of bacterial commumities for DGGE profiles from different treatment

3 结论

3.1 以打捆麦秸为固定相,以猪场废水为流动相进行厌氧发酵产沼气可以正常进行,不同猪场废水COD负荷下厌氧反应器均能正常产沼气.

3.2 猪场废水容积负荷对厌氧反应器容积产气量影响较大,对产气中甲烷含量无明显影响,当猪场废水容积负荷为7.2kgCOD/(m3·d)时,厌氧反应器最大容积产气量达 2.29m3/(m3·d),产气稳定后维持在 1.52～1.76m3/(m3·d),较猪场废水容积负荷为2.4,1.44kgCOD/(m3·d)的处理分别提高了50%和130%.

3.3 较高的猪场废水负荷虽可提高厌氧反应器容积产气量,但不利于麦秸厌氧发酵产沼气,发酵后麦秸干物质损失率、纤维素、半纤维素分解率均与猪场废水有机负荷成反比,红外的结果与之对应.

3.4 DGGE的结果表明,在反应器猪场废水COD容积负荷达7.2kgCOD/(m3·d)、发酵液HRT仅为1d条件下反应器仍能正常产气的原因在于,经过一段时间的驯化后,反应器内麦秸表面附着的微生物种类和数量(丰富度)明显高于低猪场废水有机负荷、高发酵液HRT的处理,增强了反应器耐高有机负荷冲击的能力.

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Effect of organic loading rate of piggery wastewater on biogas production of straw-bed bioreactor.

CAO Jie1,2,CHENG Guang-yin2, CHANG Zhi-zhou2*, YE Xiao-mei2, DU Jing2(1.College of Resources and Environmental Sciences,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2.East China Scientific Observing and Experimental Station of Development and Utilization of Rural Renewable Energy, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China). China Environmental Science,2014,34(5)：1200～1206

Influence of organic loading rate (OLR) of piggery wastewater on biogas production of straw-bed bioreactor was conducted under (37±1)℃ at lab scale. Higher OLR of piggery wastewater was adverse to biogas production during day 0to 25, and then daily biogas yield and volume biogas yield increased rapidly and higher than that of treatment with lower organic loading rate of piggery wastewater. The highest volume biogas yield of 2.29m3/(m3·d)was obtained at 34d with OLR of piggery wastewater of 7.2kgCOD/(m3·d). Volume biogas yield of treatment with OLR of piggery wastewater of 7.2kgCOD/(m3·d)was 1.52～1.76m3/(m3·d)which was 50% and 130% higher than that of treatment with OLR of piggery wastewater of 2.4and 1.44kgCOD/(m3·d). The higher OLR of piggery wastewater was adverse to biogas production of wheat straw and higher OLR of piggery wastewater with lower total solid, cellulose and hemicelloluse removal rate which was consistent with the result of FTIR. The result of DGGE of water extract of digested wheat straw showed that higher OLR of piggery wastewater promoted the colonization of microorganisms in the straw surface and anaerobic microbial community structure and number were much more than that of treatment with lower organic loading rate of piggery wastewater. It was feasible to use straw-bed bioreactor for biogas production with agricultural straw and livestock wastewater as fermentation materials and higher OLR of livestock wastewater with higher volume biogas yield.

piggery wastewater；straw-bed bioreactor；OLR；HRT；biogas

X705

A

1000-6923(2014)05-1200-07

2013-08-26

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07101-004);江苏省农业自主创新项目(CX(12)1002)

* 责任作者, 研究员, czhizhou@hotmail.com

曹 杰(1988-),男,江苏句容人,南京农业大学硕士研究生,主要从事固体废物处理与资源化方面的研究.