苦丁茶不同采收期多糖含量的动态累积分析

黄敏桃，吴尤娇，蔡鹃，黄云峰，赖茂祥，黄庶识，刘华钢

（1.广西科学院生物物理实验室，广西南宁530007；2.广西生态工程职业技术学院，广西柳州545004；3.广西中医药大学药学院，广西南宁530001；4.江西省赣州卫生学校，江西赣州341000；5.广西中医药研究院，广西南宁530022；6.广西医科大学，广西南宁530021）

苦 丁 茶 （Ilex Kudingcha C．J．Tseng）是 冬 青 科（Aquifoliaceae）冬青属乔木植物，别名菠萝树、大叶茶、苦灯茶、苦登茶，主产于湖南、湖北、广东、广西、海南等省。因采摘嫩梢加工制作而成，冲泡后具有先苦后甘的愉快口感，饮后余味犹存而得名，由苦丁茶冬青叶制成的苦丁茶是民间常用中草药和饮品，是传统中成药“甘和茶”的主要原料之一。据《广西万承苦丁茶》一书记载：早在元朝期间就被指定为朝廷“贡茶”，其价值由此可见一斑。叶（苦丁茶）苦、甘、凉，主要含有三萜皂苷及甾醇、茶多酚、黄酮、生物碱、氨基酸、维生素、苦味素和对人体有益的多种微量元素[1]。具有清热解毒，祛暑，主要用于治疗头痛、齿痛、目赤、热病烦渴、痢疾等症[2]。近年对苦丁茶的多糖研究较多，但是对苦丁茶多糖的月份累积未见报道。本研究选取广西1-12月份的大叶冬青苦丁茶作为样品，采用苯酚-硫酸比色，紫外可见分光光度计测定其多糖的含量，分析苦丁茶不同生长期多糖含量的动态变化规律，为苦丁茶合理采用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药材、试剂与仪器

广西苦丁茶样品采自广西南宁市地委大院，为冬青科冬青属苦丁茶冬青，采回后晾干，粉碎，备用。

浓硫酸（分析纯）：廉江市爱廉化试剂有限公司；苯酚（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

瑞士梅特勒-托利多超越型分析天平：Mettler Toledo XS105DU；紫外分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；超声仪：上海必能信超声有限公司；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

2 方法与结果

2.1 试验条件的确定

2.1.1 最佳提取条件

本研究对常温浸提、超声提取、加热回流3种方法进行单因素考察，结果表明加热回流能大大的提高了多糖的浸出率。在单因素考察基础上采用响应面法考察了提取温度、提取时间及液料比对多糖浸出率的影响，确定温度为98℃、提取时间2 h、液料比为63∶1时为多糖提取最优提取条件，进行多糖的提取。

2.1.2 测定方法

选择苯酚-硫酸法是利用糖类在浓硫酸作用下，水解成糠醛或其衍生物与苯酚缩合产生有色物质，其颜色深浅与糖的浓度成正比。

2.1.3 测定波长

配制一定浓度的葡萄糖标准溶液，以相应试剂为空白，分别在400 nm～800 nm处扫描，结果在482 nm处有最大吸收值。

2.2 苦丁茶多糖含量的测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖纯品20.03 mg，用水定容于100 mL容量瓶中，再精密吸取10.00 mL定容至50 mL容量瓶中，得到40.06 ug/mL葡萄糖溶液，再分别精密吸取葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，并用水补足至 2.0 mL，得系列对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备

精密称取苦丁茶粉末5.000 g，置于圆底烧瓶内，加蒸馏水至315 mL，称重，98℃加热回流2 h，冷却后加蒸馏水补足重量，将滤液稀释20倍，备用。

2.2.3 苯酚-浓硫酸比色试剂的配制

精密称取苯酚3.0 g，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，配置成6%的苯酚溶液，硫酸为浓硫酸试剂。

2.2.4 样品溶液的显色与测定

取上述样品供试品溶液2 mL置于10 mL比色管中，精密加入6%的苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，室温静置30 min后测定。

2.3 试验方法的考察

2.3.1 标准曲线的制备

将上述系列对照品溶液分别置于10 mL试管中，分别加入1 mL 6%苯酚溶液及5.0 mL浓硫酸，待各管加完后摇匀，室温静置30 min，482 nm测吸光度，再精密吸取2.0 mL蒸馏水，同法操作，作为空白对照。以吸光度为纵坐标（y），葡萄糖浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得回归方程为y=0. 01311x+0. 03864，R2=0. 9979，得出标准曲线（图1）。

图1 葡萄糖标准溶液曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.3.2 精密度试验

精密度试验结果见表1。

表1 精密度试验结果Table 1 Result of precision test

按2.2.4方法连续测定对照品溶液的吸光度，测得的RSD为1.05%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果Table 2 Result of stability test

按2.2.4方法每隔5 min测一次样品溶液的吸光度，连续测24次，测得的吸光度RSD为2.80%。结果表明，样品溶液在2 h内显色稳定。

2.3.4 重复性试验

重复性试验结果见表3。

表3 重复性试验结果Table 3 Result of repeatability test

按2.2.4方法制备6份7月采收的苦丁茶样品的制成的供试品溶液，测定其多糖含量平均值为68.9 mg/g，RSD为2.75%。结果表明，试验的重复性好。

2.3.5 加样回收率试验

加样回收率试验结果如表4。

表4 样品回收率试验及结果Table 4 Result of recovery test

按2.2.4方法测定5个不同浓度样品的回收率，回收率在95%～105%之间，平均回收率为98.618%，RSD为1.96%（＜2%）。

2.4 样品含量测定

按2.2.2项下样品溶液的制备方法对12个月份的广西苦丁茶样品进行制备供试品溶液，再按样品溶液的显色与测定方法在波长为282 nm下进行多糖含量的测定，得到各月份不同含糖量。样品含量测定结果见表5及图2。

表5 不同采收期的广西苦丁茶多糖含量（n=3）Table 5 Content of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months from Guangxi（n=3）

图2 不同采收期苦丁茶多糖含量变化规律（n=3）Fig.2 Curves of content polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months

3 讨论

多糖又称多聚糖（P．1ysaccharide），由单糖聚合成聚合度大于l0的极性大分子，分子量为数万至数百万，糖类与核酸、蛋白质、脂质一起合称为生命活动所必需的四大类化合物。研究表明，苦丁茶多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基具有一定的清除作用，对H2O2诱导红细胞氧化溶血反应，对红细胞自氧化溶血反应都有显著的抑制作用[3-5]。这一系列的药理研究引起广泛关注，多糖含量的研究具有重要的意义。目前多糖含量测定应用方法最多的是苯酚-硫酸法[6]，但在不同的文献报道中硫酸的加入量不同而影响多糖含量的测定结果[7]。本试验考察了样品液、6%苯酚及浓硫酸比例分别为2∶1∶5和2∶1∶7。结果显示比例为2∶1∶5所测出来的含糖量比较高，与有些文献所说的2∶1∶7结果较好有所差别[8]，原因有可能是仪器响应值的不同以及试剂的纯度有差别。苯酚-硫酸法具有操作简单、灵敏度高、显色稳定等优势，其检测结果可为多糖的研究开发及应用提供参考依据。

苦丁茶原产于广西大新县，是广西的一种道地药材，广西苦丁茶不同月份多糖含量分析的结果显示，4月份含糖量达到最高，而后慢慢下降，在11月份是含量有所提升，但是也不及4月5月的含量，12月份含量最低，如果以苦丁茶多糖生物活性作为标准，4、5月份可作为苦丁茶最佳采收期。4、5月份在广西南宁地区的气温回暖，雨水逐渐增多，多糖含量随着升高，可能与植株为了满足新芽的萌发将贮存的营养转化为可溶性糖有关。此研究结果可为苦丁茶资源的有效采摘及合理应用提供参考依据。

[1] 刘祖生.苦丁茶化学成分研究[J].浙江农业大学学报,1992,18(5)：66-69

[2] China National Corporation of Traditional arm Herbal Medicine(中国药材公司).Handbook of Chinese Traditional Medicine Resources(中国中药资源志要)[M].Beijing：Science Press,1994：689

[3] 王新,何玲玲,刘彬.苦丁茶冬青叶多糖的分离纯化及其对羟自由基的清除作用[J].食品科学,2008,29(6)：37-39

[4] Kit Man Lau,Z.-D.He.anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ethnopharmacology[J].Ethnopharmacol,2002,83(1/2)：63-71

[5] 吴晓鹏,王一飞,刘秋英,等.苦丁茶多糖抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业,2008(2)：34-36

[6] 崔红华,李超英,张大方,等.用苯酚一硫酸法测定人参多糖含量的研究[J].中国中医药信息杂志,1999,6(2)：2

[7] 刘晓河,梁惠花,谭晓红.茵陈中多糖的含量测定[J].中草药,2003,34(6)：519

[8] 王新,陆慧宁,林少琨.苦丁茶冬青叶多糖的提取及含量测定[J].时珍国医国药,2006,17(10)：1977-1979