沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃发酵特性和血清免疫指标的影响

刘艳丰 唐淑珍 张文举 侯广田*

黄仁慧3 聂存喜2 王文奇1

(1.新疆畜牧科学院饲料研究所，乌鲁木齐 830000;2.石河子大学动物科技学院，石河子 832000;3.新疆生产建设兵团第二师铁门关市畜牧兽医站，铁门关 841005)

沙棘是一种落叶性灌木，为胡颓子科沙棘属，是药食同源植物。沙棘枝叶含有丰富的营养物质和生物活性物质，沙棘黄酮为其主要活性成分。中国沙棘叶中黄酮含量为86.7 mg/kg，比果实含量高 2.4倍，而且海拔越高，黄酮含量越高［1］。沙棘黄酮具有增强机体免疫功能的作用，还具有抗炎、抗病毒、抗过敏、抗疲劳等其他作用［2］。大量研究表明，在饲养动物饲粮中应用沙棘叶或沙棘叶黄酮，可以促进和调节生长发育［3－6］，提高饲料报酬［7］，增强机体抗病能力，增强机体免疫性能［8］。另外，沙棘枝叶来源广，价格低廉，易加工、贮藏和运输，适合用作饲料添加剂［9］。瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸(VFA)是反刍动物重要的能量来源，约占反刍动物能量吸收总量的70%～80%［10］。为此，本试验通过在阿勒泰羊饲粮中添加不同比例的沙棘嫩枝叶，研究其对绵羊瘤胃发酵特性及血清免疫指标的影响，以期为沙棘嫩枝叶在绵羊饲粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙棘嫩枝叶采自新疆维吾尔自治区青河县，为枝杆直径少于1 cm沙棘嫩枝条;自然晾干。沙棘嫩枝叶的干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、总磷含量分别为92.62%、11.73%、5.04%、9.14%、29.94%、20.34%、0.41%、0.18%，总能 15.70 MJ/kg，以上测定结果均为风干基础。

1.2 试验设计和饲粮

采用单因素随机区组试验设计，选择体重为(28.0±3.5)kg 的阿勒泰羔羊 60 只，随机分成 4组，每组3个重复，每个重复5只，重复之间体重接近。对照(Con)组饲喂基础饲粮，试验组以2.5%(SJZY-1 组)、5.0%(SJZY-2 组)和 7.5%沙棘嫩枝叶(SJZY-3组)等量替换基础饲粮中麦秸。试验期63 d，其中预试期7 d，正试期56 d。参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)［11］及试验羊场的常用饲粮配方，配制育肥羊的全混合粉状饲料。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 饲养管理

试验前对羊舍进行消毒。试验羊按重复群饲，预试期按组打好耳号，免疫注射羊痘、口蹄疫和三联四防苗，并进行驱虫。日喂2次，分别为每天的08:00和19:00，每次以吃饱剩料约10%为准，自由饮水。其他饲养管理措施和免疫接种按羊场的常规程序进行。在预试期内试验组由基础饲粮逐渐过渡到试验饲粮。试验期间羊舍内温度和湿 度分 别为 (15.78±0.61)℃ 和 (60.12±1.80)%。

1.4 样本采集与制备

在正试期第56天当日早晨空腹，分别从各组每个重复随机选取2只，即每组6只，共24只试验羊，颈静脉采集血样和利用自制活体瘤胃取样器抽取瘤胃液约50 mL。

用真空采血管颈静脉采血5 mL，静置10 min后，于2 700×g离心15 min，分离血清分装于 Eppendorf管中，置于－20℃冷冻保存，用于血清免疫指标的测定。

采集的瘤胃液迅速测定pH，用4层乳酪布过滤，部分2 700×g 离心15 min，取0.5 mL 上清液用来测定氨态氮(NH3-N)浓度;另取10 mL上清液加25%的偏磷酸1 mL，放入液氮中带回实验室，置于－70℃冷冻保存，待测定VFA浓度。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 生长性能的测定

试验过程详细观察与记录试验羊的健康和生长状况，分别在预试期、正试期第1和56天，以个体为单位对所有试验羊进行空腹称重，试验过程以重复为单位详细记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量。营养水平的测定均采用国标或行业标准方法，GB/T 6435—1986测定干物质含量，GB/T 6432—1994测定粗蛋白质含量，GB/T 6433—2006测定粗脂肪含量，GB/T 6438—1992测定粗灰分含量，GB/T 20806—2006测定中性洗涤纤维含量，NY/T 1459—2007测定酸性洗涤纤维含量，GB/T 6436—2002测定钙含量，GB/T 6437—2002测定总磷含量，GB/T 5009.10—2003测定粗纤维含量。氧弹式热量计法测定总能。

1.5.2 瘤胃液 pH

瘤胃液pH用便携式pH计测定。

1.5.3 瘤胃液 VFA 浓度

瘤胃液VFA浓度的测定参照秦为琳［12］的方法进行。

色谱条件:安捷伦6890N气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器(FID)。进样口温度250℃，分流进样，分流比为10∶1，进样量1μL。色谱柱 DBWAX 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气流量1.2 mL/min。程序升温为120℃保持1 min，以5℃/min的速率升至200℃，FID温度300℃，氢气流量 40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量 30 mL/min。

1.5.4 瘤胃液 NH3-N 浓度

瘤胃液NH3-N浓度用酚－次氯酸钠比色法［13］测定。

1.5.5 血清免疫因子浓度

血清CD4、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(γ-IFN)浓度采用绵羊专用试剂盒(美国Blue Gene公司)进行测定，检测仪器为Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

1.6 数据处理和统计分析

试验数据用Excel 2007初步整理和计算后，采用SPSS 19.00统计软件中ANOVE进行单因子方差分析，并进行Duncan氏法多重比较，以 P＜0.05、P＜0.01 为差异显著、极显著的判断标准。结果表示以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 沙棘嫩枝叶对绵羊生长性能的影响

由表2可知，各组间初始重、末重和平均日采食量均差异不显著(P＞0.05)。SJZY-3组平均日增重最高，SJZY-3组、SJZY-1组平均日增重均与Con组差异显著(P＜0.05)，分别提高 22.58%和21.82%。

2.2 沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃发酵特性的影响

由表3可知，随着沙棘嫩枝叶添加量的增加，瘤胃液 pH、乙酸/丙酸和乙酸/总挥发性脂肪酸(TVFA)、NH3-N浓度呈下降趋势，乙酸、丙酸、丁酸和TVFA的浓度呈上升趋势。瘤胃液pH、乙酸/丙酸和乙酸/TVFA组间差异不显著(P＞0.05)。试验组乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度均极显著高于 Con组(P＜0.01)，SJZY-3 组最高，显著或极显著高于其他各组(P＜0.05 或 P＜0.01)。SJZY-2 组和SJZY-3组NH3-N浓度分别显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)低于 Con 组。

表2 沙棘嫩枝叶和沙棘提取物对绵羊生长性能的影响Table 2 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on growth performance of sheep

表3 沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃发酵特性的影响Table 3 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on rumen fermentation characteristics of sheep

2.3 沙棘嫩枝叶对绵羊血清免疫指标的影响

由表4可知，SJZY-3组血清CD4浓度显著高于 Con组和 SJZY-2组(P＜0.05)，极显著高于SJZY-1组(P＜0.01)。SJZY-2组血清 IL-1浓度显著高于 Con组(P＜0.05)，极显著高于 SJZY-1组(P＜0.01)。SJZY-3组血清 IL-2浓度显著高于SJZY-1组(P＜0.05)。SJZY-1组血清 γ-IFN 浓度显著高于 Con 组(P＜0.05)。

表4 沙棘嫩枝叶对绵羊血清免疫指标的影响Table 4 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on serum immune indices of sheep

3 讨 论

3.1 沙棘嫩枝叶对绵羊生长性能的影响

本试验中用沙棘嫩枝叶等量替换麦秸后，平均日增重显著比对照组高。沙棘枝叶提高绵羊生产性能的作用与其富含的营养物质和生物活性成分密切相关。沙棘嫩枝叶的粗蛋白质含量达11.73%，优于麦草和玉米秸等，同时，沙棘叶还富含大量的沙棘黄酮、微量元素、氨基酸和维生素(其中维生素 C含量为1 270 mg/kg)［14］等，这些物质对动物的生长和发育具有良好的促进作用。郭福存等［4］研究表明，每只奶山羊添加饲喂25 g/d沙棘叶，可提高产奶量6.24%，提高饲料转化率6.14%;添加饲喂50 g/d沙棘叶，可使奶山羊产奶量提高6.88%。邵淑丽等［15］研究表明，5%沙棘嫩枝叶可使鸡对饲粮中蛋白质利用率提高6.82%，平均日增重提高5.50%，饲料报酬提高19.48%。本试验中，饲粮添加7.5%沙棘嫩枝叶可显著提高绵羊平均日增重，提高了22.58%。与习文东等［16］报道基本一致。而程文杰等［7］在绵羊饲粮中添加500 g/d沙棘嫩枝叶，对试验羊的采食量、平均日增重没有影响，可能与饲喂量较大，而枝叶有酸涩味有关。综合前人研究成果，饲粮添加适量沙棘枝叶在反刍动物和蛋鸡中应用效果都优于常规饲料。

3.2 沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃发酵特性的影响

瘤胃液pH是反映反刍动物瘤胃发酵状态最直观的一项指标，可以综合反映瘤胃微生物、代谢产物、有机酸的产生、吸收、排除及中和的状况，稳定的pH对维持瘤胃内环境具有主导作用。保持pH在一个正常的范围是确保瘤胃正常发酵的前提［17］，本试验中，添加沙棘嫩枝叶后 pH 在 6.25～6.45，相对恒定，沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃液pH没有显著的影响。

瘤胃内VFA浓度和比例是绵羊瘤胃发酵的重要指标，能够反映瘤胃内部的环境状况及饲料在瘤胃内的发酵程度和模式［18］。乙酸、丙酸和丁酸占到TVFA的95%以上，其浓度和比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标。乙酸是重要的中间代谢产物，是体内许多重要物质的前体物，其作为葡萄糖前体物对反刍动物是非常重要的。在饲粮中添加沙棘嫩枝叶使VFA浓度显著增加，表明沙棘嫩枝叶对瘤胃微生物类群数量或者代谢能力有一定程度的提高。瘤胃液VFA浓度与瘤胃微生物对饲粮中碳水化合物的降解有密切关系。本试验结果表明，饲粮中添加沙棘嫩枝叶可提高瘤胃液VFA浓度，说明沙棘嫩枝叶能够提高饲粮中碳水化合物在瘤胃中的降解程度。

丙酸是反刍动物体内糖异生的重要前体物质。本试验中，饲粮中添加沙棘嫩枝叶能够提高瘤胃液丙酸浓度，而且瘤胃液乙酸浓度并不是因丙酸浓度的增加而降低，乙酸/丙酸有下降趋势，从侧面说明丙酸产生菌受到的刺激效应要大于乙酸产生菌，进一步表明绵羊饲粮中添加了沙棘嫩枝叶促进乙酸和丙酸的代谢。

瘤胃内的NH3-N是瘤胃微生物合成菌体蛋白的原料。其浓度反映了瘤胃内微生物氮的供应状况。瘤胃内NH3-N浓度较低，表明瘤胃微生物合成作用较强。本试验中随着饲粮沙棘嫩枝叶添加量的增加，NH3-N浓度降低，表明沙棘嫩枝叶有促进瘤胃微生物合成的作用。

3.3 沙棘嫩枝叶对绵羊血清免疫指标的影响

细胞因子具有免疫调节作用，而且淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调节功能所必需的［19］。CD细胞的数量直接反映外周免疫器官中总T细胞的水平，而CD4、CD4/CD8高，表明机体处于高的免疫状态。沙棘的乙醇提取物可恢复由辐射(60Co-γ)导致的 CD4+/CD8+降低，从而通过调节T细胞亚群对细胞免疫功能产生特殊的调节作用［8］。本试验结果表明，添加沙棘嫩枝叶可以显著提高CD4浓度，可能是由于刺激和促进了T细胞亚群的分泌［20］，从而提高了绵羊的免疫功能。

IL-1是炎症反应早期最具影响的介质之一，主要由单核巨噬细胞产生、释放。它不仅能够协同其他细胞因子促进B、T细胞活化，而且能够诱导其他炎性介质产生，加强白细胞与内皮细胞的黏附。本试验中，沙棘嫩枝叶能够增加IL-1浓度，而且IL-2、γ-IFN浓度也随之增加，表明机体免疫功能得到改善。

IL-2的主要生物活性是促进T细胞和自然杀伤细胞的增殖，促进B细胞分化和增殖，促进抗体生成等。因此IL-2在机体免疫应答、免疫调节和抗肿瘤免疫中具有重要作用，是机体细胞免疫功能的重要指标之一。在断奶仔猪饲粮中添加0.1%沙棘提取物可以提高血清IL-2、γ-IFN浓度，促进免疫器官增重，提高T细胞中CD4的比例，增强断奶仔猪的免疫功能［21］。IL-2和 γ-IFN 在促进CD4+和CD8+的增殖方面表现出显著的协同作用［22］，IL-1 和 γ-IFN 能 促 进抗体的生成［23－24］。IL-2诱导产生细胞毒性T细胞(TC)也可使致敏的TC活性加强，同样也可促进T辅助细胞增殖并维持其在体外长期增长，还能显著增强免疫干扰素和肿瘤坏死因子的生成，增强自然杀伤细胞和TC的功能［25］。Geetha 等［26］研究发现，在没有刀豆蛋白A的情况下，沙棘提取物(100μg/mL)能单独地刺激IL-2和γ-IFN的产生，能抑制由铬导致的IL-2和γ-IFN产生量减少。本试验中，SJZY-3组血清IL-2浓度高于对照组，表明沙棘嫩枝叶能诱导T细胞增殖，调控绵羊免疫器官的生长发育，产生增殖反应和分泌细胞因子，因而自然杀伤活性得到增强，而且促进了B细胞的增殖和巨噬细胞的活化［27］，这在绵羊的生长发育过程中，起到了积极的防御和调控作用，达到加强机体整体免疫机能的作用。

4 结论

①沙棘嫩枝叶能提高绵羊平均日增重，增加瘤胃液中VFA浓度和降低NH3-N浓度，提高血清CD4、IL-1、IL-2、γ-IFN 浓度。

②综合考虑，建议沙棘嫩枝叶在绵羊饲粮中以 5.0%～7.5%添加。

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