α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

陈敬帮，周银华，赵新宇,2，陈守文，魏雪团,2,*

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

陈敬帮1，周银华1，赵新宇1,2，陈守文1，魏雪团1,2,*

（1.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

研究不同地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）宿主菌对α-淀粉酶分泌表 达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子，B. licheniformisWX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件，构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B. licheniformis宿主菌：WX-02（ΔamyL）、BL9和BL10，获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02（ΔamyL，pP43SAT）、BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL，比原始宿主菌WX-02（ΔamyL，pP43SAT）分别提高了21%和31%，这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达，为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。

α-淀粉酶；地衣芽孢杆菌；宿主菌；分泌表达

α-淀粉酶可水解淀粉，产生糊精、低聚糖和单糖，在食品、医药和纺织品领域应用广泛[1-2]。基因工程技术常用来提高目标蛋白的产量，李金霞等[3]通过大肠杆菌宿主菌实现了α-淀粉酶的表达，但大肠杆菌表达系统易形成包涵体，且外膜含有对人和动物有毒性的内毒素脂多糖，产物分离纯化比较困难[4]。相比之下，地衣芽孢杆菌为食品级微生物，具有较高的安全性，且最适生长温度高，生长速度快，细胞壁组成简单，蛋白分泌能力强[5]。王凤寰等[6]通过同源整合技术，构建了含透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌宿主菌，显著提高了α-淀粉酶的发酵活性。牛丹丹等[7]采用同源介导α-淀粉酶基因扩增技术，提高了基因拷贝数，显著提高了α-淀粉酶的发酵活性。杨艳华等[8]通过过量表达调控基因degQ，显著提高了α-淀粉酶的表达水平。Ghang等[9]选择不同酿酒酵母表达α-淀粉酶基因，最大淀粉酶活性提高了10倍，而Galdino等[10]发现α-淀粉酶在酿酒酵母中的表达活力仅为3.93 U/mL。由此可见，宿主菌对外源蛋白的表达影响很大，宿主菌的改造对α-淀粉酶的发酵生产至关重要。

宿主菌的胞外蛋白酶可降解目标蛋白，从而降低目标蛋白的表达量。因此，缺失其胞外蛋白酶可能抑制目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白的表达量。Ignatova等[11]采用不同的大肠杆菌宿主菌表达青霉素酰化酶，发现多蛋白酶基因缺失可显著提高青霉素酰化酶的表达量。Nguyen等[12]利用8蛋白酶基因缺失的枯草芽孢杆菌WB800为宿主菌，显著提高了纳豆激酶的表达量。WX-02为本课题组前期筛选的一株地衣芽孢杆菌[13]，可高产聚谷氨酸[14-15]、2,3-丁二醇[16]和乙偶姻[17]，在WX-02的基础上，通过叠加敲除的手段分别构建了多蛋白酶基因缺失的新型宿主菌，前期研究结果证实多基因缺失宿主菌可显著提高纳豆激酶的表达量[18]。多蛋白酶基因缺失的宿主菌还未应用于α-淀粉酶的表达，无法理解宿主菌蛋白酶缺失对α-淀粉酶的影响，阻碍该策略在α-淀粉酶表达中的应用。本研究以前期构建的多基因缺失宿主菌BL9和BL10为宿主菌进行α-淀粉酶的分泌表达，评价多蛋白酶基因缺失对α-淀粉酶表达的影响，为α-淀粉酶的高效表达提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌株

表1为实验所用菌株。其中BL9缺失7个蛋白酶基因（mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL）和1个鞭毛蛋白基因（hag），同时为了排除自身基因组中α-淀粉酶基因对α-淀粉酶表达的影响，还缺失了α-淀粉酶基因（amyL），BL10是在BL9的基础上进一步敲除了蛋白酶基因bprA。

表1 实验所用菌株Table1 A list of the strains used in this study

1.1.2试剂

DNA聚合酶、dNTPs、各种DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RNA酶、蛋白质标准Marker、DNA Marker日本TaKaRa公司；DNA回收试剂盒 武汉思特进科技发展有限公司；琼脂糖 法国Biowest公司；氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、四环素（tetracycline，Tet）、蛋白胶配制所需试剂 美国Sigma公司；其他主要生化试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3培养基

LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，固体培养基加琼脂15 g/L。

芽孢杆菌感受态制备培养基：生长培养基为含0.5 mol/L山梨醇的LB培养基；洗涤培养基为0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10%甘油；恢复培养基为含0.5 mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇的LB培养基。

淀粉酶发酵培养基：玉米浆干粉5 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、柠檬酸钠12 g/L、K2HPO4·H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2·2H2O 0.15 g/L，pH 7.0～7.2。

抗生素质量浓度：大肠杆菌克隆筛选和培养使用Amp质量浓度为100μg/mL；芽孢杆菌转化子筛选使用Tet质量浓度为20μg/mL，重组菌株的培养使用Tet质量浓度为25μg/mL。

1.2仪器与设备

凝胶成像系统 美国Alpha公司；GenePulserTM电脉冲转化仪 美国Bio-Rad公司；HQL300B恒温大幅振荡摇床 武汉中科科仪技术发展有限责任公司；高压灭菌锅 日本三洋公司；电子分析天平（万分之一）德国Sartorius Analytic公司。

1.3方法

1.3.1α-淀粉酶分泌表达载体构建

α-淀粉酶分泌表达载体构建参考本课题组先前报道的方法[19]，构建步骤如图1所示。根据B. licheniformisWX-02基因组序列中的amyL基因序列（MUY_00877），设计一对引物PamyLF1（5’-GAGAGGAATGTACA CATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3’）和PamyTR（5’-GAAGATCTCGCAATAATGCCGTCGCAC TG-3’），以B. licheniformisWX-02的总DNA为模板，聚合酶链 式反应（polymerase chain rea ction，PCR）扩增得到α-淀粉酶基因的编码区（包括信号肽）片段和终止子片段amyL+TamyL，长度约2 040 bp。 根据B. subtilis168基因组上P43启动子的序列设计一对引物P43F（5’-GG AATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’）和P43R1（5’-AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACA TTCCTCTC-3’），PCR扩增得到启动子P43片段，长度约305 bp，将这两个片段经DNA纯化试剂盒纯化回收后作为模板，用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR，SOE-PCR）连接在一起，得到片段SAT，总长度约2 345 bp，纯化回收后，用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切，纯化回收片段SAT。然后将pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接。连接产物转化E. coliDH5α，转化子经菌落PCR验证、质粒抽提和双酶切验证，获得的重组α-淀粉酶分泌表达质粒命名为pP43SAT，长度约4 870 bp。

图 1 1 α-淀粉酶表达载体pP43SAT的构建过程Fig.1 Construction process of α-amylase expression vector (pP43SAT)

1.3.2α-淀粉酶重组表达菌株的构建

重组表达菌株参考本课题组先前报道的方法构建[18]。分别接种B. licheniformisBL9和BL10于LB培养基，37℃、180 r/min过夜培养，转接至电转化生长培养基中，250 r/min、37℃培养至OD600nm为0.8～0.9，冰浴10 min，5 500 r/min离心6 m in，收集菌体，用电转化洗涤培养基洗涤菌体3次，重悬于洗涤培养基中，即为感受态细胞。取感受态细胞加入5μLpP43SAT质粒DNA（50 ng/μL），转至预冷的电转化杯（0.2 cm）中，冰浴1～1.5 min，用电脉冲转化仪2.5 kV电击1次，迅速加900μL电转化恢复培养基，37℃水浴1 h，100 r/min恢复培养2 h，涂含有20μg/mL的四环素抗性平板，37℃培养20 h，挑取转化子，经菌落PCR验证、质粒抽提验证，获得阳性转化子，通过该方法构建重组表达菌株B. licheniformisBL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并构建含有空质粒pHY300PLK的对照表达菌株。

1.3.3重组发酵菌株的发酵培养

将B. licheniformisBL9（pP43SAT），BL10（pP43SAT）和对照菌株接种于5 mL的含四环素（20μg/mL）的LB培养基中，37℃、180 r/min培养过夜。再以4%的接种量转接到50 mL新鲜的LB培养基中，直到OD600nm为1.0时，以1%的接种量接种到50 mL新鲜的淀粉酶发酵培养基中，37℃、180 r/min振荡培养。每隔4 h取样一次，测定 其OD600nm和淀粉酶活力，取发酵终点的发酵液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，鉴定淀粉酶的表达。

1.3.4表达蛋白的鉴 定

取0.9 mL发酵上清液，加入0.1 mL 100 g/100 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，颠倒10次混匀，4℃过夜放置，13 000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.2 mL无水乙醇洗涤，13 000 r/min离心10 min，弃上清，依此重复洗涤3次，37℃吹干，加入30μL包含8 mol/L尿素和2 mol/L硫脲的溶液溶解蛋白 样品，再加入30μL2×SDS-PAGE上样缓冲液和3μL1 mol/L二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），100℃水浴10 min溶解沉淀。SDS-PAGE凝胶参考《分子克隆实验指南》进行配制[20]。将溶解好的蛋白离心后取20μL上样，用80 V的电压电泳，当溴酚蓝指示剂从浓缩 胶进入分离胶后，电压调到120 V，继续电泳直到溴酚蓝指示剂抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。电泳结束后，于考马斯亮蓝R250染色液 中处理1～2 h，最后于脱色液中处理数次直至条带清晰。

1.3.5α-淀粉酶活力测定

发酵液经1 000 r/min离心10 min，取上清液，稀释即为待测样品。吸取20.0 mL 2 g/mL可溶性淀粉溶液于50 mL离心管中，加入5 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.0）摇匀后置于60℃恒温水浴锅中预热8 min。加入1 mL待测样品，摇匀，反应10 min。吸取1.00 mL反应液至预先盛有0.5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和5 mL稀碘液的离心管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5 mL稀碘液为空白，在660 nm波长处迅速测定其吸光度（A）。淀粉酶活力单位为U/mL，1 U定义为：在60℃、pH 6.0的条件下1 min水解1 mg淀粉所需的酶量[21]。

2 结果与分析

2.1α-淀粉酶表达质粒pP43SAT的构建

以设计在pHY300PLK载体上PHY-F/PHY-R为引物，通过菌落PCR初步挑选阳性克隆子。挑取候选阳性克隆子过夜培养，抽质粒，酶切验证结果如图2所示，pP43SAT质粒经过BglⅡ和EcoRⅠ双酶切后，得到片段大小约为4 870 bp和2 345 bp的两个片段，分别与空质粒pHY300PLK和片段SAT大小相等，说明pP43SAT质粒构建成功。

图2 表达质粒pP43SAT的酶切鉴定Fig.2 Identification of expression vector pP43SAT by restriction enzyme digestion

2.2α-淀粉酶表达蛋白鉴定

图3 不同基因工程菌胞外蛋白的SDS-PAGE图谱分析结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of extracellular proteins from different genetically engineered strains

将构建好的α-淀粉酶表达载体pP43SAT分别转入BL9和BL10，得到工程菌株BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并在BL10中转入空质粒pHY300P LK得到对照菌BL10（pHY300PLK），抽质粒进行验证，经过液体发酵，取发酵24 h时的发酵液样品，在相同条件下进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。与空白对照相比，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）菌株发酵液中含有强烈的α-淀粉酶条带，大小约58 kD，与先前报道的B. licheniformis α-淀粉酶的分子质量相一致[22]，说明α-淀粉酶在BL9和BL10中实现了分泌表达。从α-淀粉酶条带强度可以看出，BL10宿主菌具有更高的α-淀粉酶表达量。BL10是在BL9的基础上敲除了bprA基因，说明宿主菌缺失蛋白酶BprA可进一步提高α-淀粉酶的表达。

2.3不同宿主菌对α-淀粉酶发酵过程的影响

图4 不同宿主菌对α-淀粉酶发酵过程的影响Fig.4 Effects of different host strains on the fermentation process of α-amylase

为了对比BL9、BL10和野生菌WX-02的α-淀粉酶表达效果，并排除B. licheniformis自身α-淀粉酶对蛋白表达的影响，将pP43SAT表达载体转入缺失α-淀粉酶基因的WX-02（ΔamyL）宿主菌中，构建了B. licheniformisWX-02（ΔamyL，pP43SAT）。WX-02（ΔamyL，pP43SAT）、BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）的淀粉酶发酵过程如图4所示。与WX-02（ΔamyL，pP43SAT）相比，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）菌体生长相对缓慢，最终生物量微弱下降（图4A），这可能是由于BL9和BL10菌株分别缺失9个和10个基因，对菌体的生长具有微弱的损伤作用，这与本课题先前发现的现象相似[18]。

微弱降低的菌体量并没有降低淀粉酶的表达量，如图4B所示，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL，比WX-02（ΔamyL，pP43SAT）的发酵活力（77.88 U/mL）提高了21%和31%，这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于α-淀粉酶的表达，这与先前报道的纳豆激酶变化趋势相符合[18]。B. licheniformis宿主菌缺失蛋白酶基因后，可降低自身蛋白酶对目标蛋白的降解作用，这可能是淀粉酶表达活性增加的原因。同时，BL10（pP43SAT）的α-淀粉酶表达活性相对于BL9（pP43SAT）提高了8%，这与SDS-PAGE的蛋白质浓度变化趋势相一致，进一步说明BprA蛋白酶的缺失有利于α-淀粉酶的表达。

3 结 论

本研究构建了α-淀粉酶表达载体pP43SAT，实现了α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌宿主菌WX-02（ΔamyL）、BL9和BL10中的成功表达。与宿主菌WX-02（ΔamyL）相比，BL9和BL10可显著提高α-淀粉酶的表达，分别提高了21%和31%。目前，以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失株为宿主表达外源蛋白的研究较多，如6蛋白酶缺失株B. subtilisWB600可高效表达纳豆激酶[23]和枯草蛋白酶[24]，8蛋白酶缺失株B. subtilisWB800可高效表达木聚糖酶[25]和磷脂酶C[26]，而多蛋白酶缺失的地衣芽孢杆菌宿主菌报道较少，本课题组前期证明BL10有利于纳豆激酶的表达，本研究证明胞外蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达，进一步证实多蛋白酶缺失宿主菌的应用价值。更重要的是，本研究为α-淀粉酶的增强表达提供了新的思路，提供了一种高效表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌工程菌BL10（pP43SAT），相信经过进一步的发酵工艺优化和中试放大研究，该菌株有望应用于α-淀粉酶的工业化生产。

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Comparative Analysis on the Effects of Different Host Strains of Bacillus licheniformis on the Expression and Secretion of α-Amylase

CHEN Jingbang1, ZHOU Yinhua1, ZHAO Xinyu1,2, CHEN Shouwen1, WEI Xuetuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In the present study, effects of different host strains ofBacillus licheniformison the expression and secretion ofα-amylase were investigated. Firstly, theα-amylase expression vector, named pP43SAT, was constructed based on the promoter P43 fromBacillus subtilisand the signal peptide, coding region and terminator ofα-amylase gene fromB. licheniformisWX-02. The pP43SAT plasmids were then transformed into theB. licheniformishost strains WX-02 (ΔamyL), BL9 and BL10B, respectively, to obtain theα-a mylase genetic engineering strainsWX-02 (ΔamyL;pP43SAT), BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT), respectively. Theα-amylase fermentation processes of these engineered strains were compared.Theα-amylase activities ofstrains BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT) reached 94.01 and 101.94 U/mL, respectively, which were increased by 21% and 31%, respectively, as compared with that of WX-02 (ΔamyL;pP43SAT). These results showed that the novel host strains BL9 and BL10 contributed to the secretion and expression ofα-amylase. It was proved that the deletion of multiple proteases genes could enhanceα-amylase expression obviously, and this st udy provided the novel host strains and novel strategies for efficient expression ofα-amylase.

α-amylase;Bacillus licheniformis; host strain;secretion and expression

Q812

1002-6630（2015）17-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201517037

2015-04-10

湖北省自然科学基金项目（2014CFB943）；华中农业大学自主科技创新基金项目（2662015QC035）

陈敬帮（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品酶学。E-mail：1176154594@qq.com

*通信作者：魏雪团（1984—），男，讲师，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn