胃黏膜相关组织淋巴瘤组织中m iR-142-5p及m iR-155表达及其临床意义

章志坚 丁如良 王荣国 林雪君 廖南生 许喜娟 韩少良 吴秀玲

1.浙江省台州市第一人民医院胃肠外科，浙江台州318020;2.温州医科大学附属第一医院胃肠外科，浙江温州325000

胃黏膜相关组织淋巴瘤组织中m iR-142-5p及m iR-155表达及其临床意义

章志坚1丁如良1王荣国1林雪君1廖南生1许喜娟1韩少良2吴秀玲2

1.浙江省台州市第一人民医院胃肠外科，浙江台州318020;2.温州医科大学附属第一医院胃肠外科，浙江温州325000

目的筛选胃黏膜相关组织(MALT)淋巴瘤的microRNAs(miRNAs)谱，并探讨miRNAs表达与胃MALT淋巴瘤临床病理生物学行为的关系。方法收集台州市第一人民医院和温州医科大学附属第一医院2003年1月～2013年6月间手术治疗胃MALT淋巴瘤47例，检测手术切除标本的石蜡miRNAs水平，并比较miRNAs谱中miR-142-5p及miR-155的表达及其临床意义。结果胃MALT淋巴瘤组织中有38条miRNA上调，包括差异17倍miR-142-5p和4.5倍miR-155;另外，有28条下调包括miR-34a表达差异为4.9倍。本研究结果发现胃MALT淋巴瘤组织miR-142-5p及miR-155表达显著高于相应正常胃黏膜(P＜0.01)，且Hp感染阳性胃MALT淋巴瘤病例miR-142-5p相对表达量显著低于Hp感染阴性病例(0.65比1.29，P=0.022)，且较大肿瘤(≥5 cm)病例的miR-142-5p相对表达量显著高于小肿瘤(＜5 cm)病例(1.63比1.36，P=0.038)，肿瘤浸润深度超过肌层及全层病例的m iR-142-5p表达显著高于肿瘤浸润局限于黏膜及黏膜下层病例(1.19比0.67，P=0.041)，且Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期组miR-142-5p相对表达量显著高于Ⅰ期病例(1.36比0.67，P=0.034)。另外，本资料表明Hp感染阳性胃MALT淋巴瘤病例miR-155相对表达量显著低于Hp感染阴性病例(1.34比11.46，P=0.010)，且较大肿瘤(≥5 cm)病例的miR-155相对表达量显著低于小肿瘤(＜5 cm)病例(1.34比4.36)(P=0.048)，肿瘤浸润深度超过肌层及全层病例的miR-155表达显著高于肿瘤浸润局限于黏膜及黏膜下层病例(1.86比1.37，P=0.048)，且Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期组miR-155相对表达量显著高于Ⅰ期病例(13.90比1.81，P=0.009)。结论胃MALT淋巴瘤组织与正常胃组织之间miRNAs表达差异显著，尤其是miR-142-5p及miR-155基因，且这两种基因表达与肿瘤大小、核分裂像及恶性程度等密切相关，提示miRNA在胃恶性淋巴瘤的发生发展过程中发挥重要作用。

胃黏膜相关组织淋巴瘤曰m iRNA曰生物学行为

胃淋巴瘤是常见的结外淋巴瘤，以侵袭性高、对常规化疗不敏感及预后差的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)为主。黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤是一组惰性的低度恶性淋巴瘤，但随着疾病的进展可转化为高度恶性的DLBCL［1-3］。microRNAs(miRNAs)是近年来研究发现的一类长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，它是对基因具有调控功能的内源性非编码小分子RNA，miRNAs通过直接剪切靶mRNA或者通过完全/不完全与靶miRNAs的3＇端互补结合，引起mRNA降解或翻译抑制，从而对基因转录后水平进行调控［4-5］。近年来研究表明miRNAs在人体多种生物学过程中起着至关重要的作用，包括细胞增殖、分化、凋亡等，且这些miRNAs的表达异常能导致疾病甚至肿瘤的发生，有类似于抑癌基因或癌基因的功能［4-10］。

最近研究表明一些miRNAs(包括miR-142-5p、miR-155及miR-34a)与B细胞淋巴瘤发生发展密切相关［4-6］。miR-155对应的是非编码RNA的一个外显子，转录于21号染色体B细胞整合簇(BIC)区域，主要表达在造血细胞［5-8］，且在霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和胰腺癌中均表达增高［7-9］。BIC是一个不含开放读码框的基因，过表达BIC可促进细胞异常增殖。位于BIC第三个外显子内的miR-155表达水平受BIC的转录水平和miRNA加工等调控，miR-155与BIC的表达水平在B细胞淋巴瘤(霍奇金、弥漫大B淋巴瘤)和乳腺癌等肿瘤中发生上调，但在Burkitt淋巴瘤中表达水平偏低［10］。且过表达miR-155的转基因小鼠出现B细胞异常增殖。但到目前为止，有关miRNAs表达与胃MALT型淋巴瘤生物学行为和预后影响的研究尚未见文献报道。本研究筛选胃MALT淋巴瘤的miRNAs谱，并探讨miRNAs表达与胃MALT淋巴瘤临床病理生物学行为的关系。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集浙江省台州市第一人民医院和温州医科大学附属第一医院2003年1月～2013年6月间手术治疗胃MALT淋巴瘤47例，其相应的非瘤正常胃组织取自距肿瘤边缘10 cm非瘤胃黏膜。所有对象术前均未接受幽门螺旋杆菌清除治疗等。本组包括男30例，女17例，男女比例为1.8∶1，年龄27～76岁，平均(59.5± 7.3)岁，其中≥60岁31例，肿瘤直径2～14 cm，平均(3.7±2.4)cm，所有病例均经免疫组织化学染色确诊，记录临床资料、胃镜检查结果、病理资料、用药情况及生存情况等。

1.2 病理检查

参照Isaacson胃肠黏膜相关淋巴瘤的组织学诊断标准，并根据1994年修订的Real分类和2001年新淋巴瘤分类所选择的病例进行组织学分类，由两位主任医师对所有的病例进行病理重新观察，选用LCA及CD系列抗体:CD5、CD10、CD19、CD20、CD79α、CD23、CD45RO等单克隆抗体对所有病例进行标记，进一步作出正确分类诊断，去除其他B细胞型淋巴瘤(套细胞型、小淋巴细胞型或滤泡型)，根据Musshoff分期系统(1994年)分期法进行临床分期。

1.3 Hp感染情况检测

用快速尿素酶试验和组织学碱性品红法检测胃MALT淋巴瘤组织Hp表达情况。

1.4 石蜡组织总RNA抽提

切取石蜡标本10μm厚切片×6张，按照High Pure miRNA Isolation Kit试剂说明书提取总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。采用德国Eppendorf公司分光光度仪检测RNA溶液OD260/OD280吸光值，计算RNA浓度和纯度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于检测。1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.5 m iRNA的表达分析

①4μg总RNA分别以miRNA茎环RT引物进行逆转录，反应条件为:16℃30min，42℃30min，75℃15min，反应结束后-20℃保存。②以15μL反应体系进行Real-time定量PCR。MiRNA检测反应体系包括: 1μLRT产物，1×SYBRGreenⅠMastermix，0.5μmol/L miRNA特异前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。Real-time定量PCR条件为:95℃10min后，95℃15 s，60℃1 min，40次循环。Real-time定量PCR使用Applied Biosystems 7500仪器进行。所有样品做3个复孔。PCR产物经8%PAGE电泳分析。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值。③根据相关文献［11］，以miR-let7a作为内参，分析miRNAs的表达。④采用定量PCR中的相对定量法［11］，以2-ΔΔCt表示肿瘤组织目的基因的表达相对于配对的正常组织的变化倍数，其中ΔΔCt=(肿瘤CtmiRNA-肿瘤Ctlet-7a)-(正常CtmiRNA-正常Ctlet-7a)(表1)。

1.6 随访

对出院后用药情况、复发时间、生存时间及死亡原因等进行随访，直至数据分析统计时(2013年6月)。

表1 miRNA茎环RT Real time PCR检测相关引物序列

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差()表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 m iRNAs芯片检测结果

以let-7a为内参，检测66条与胃淋巴瘤发生相关的miRNAs，与正常胃黏膜表达相比，胃MALT淋巴瘤组织中有38条miRNA上调(let-7c、miR-100、miR-103、miR-107、miR-123、miR-125b、miR-126、miR-130a、miR-140、miR-142-5p、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-15a、miR-15b、miR-150、miR-151-5p、miR-155、miR-16、miR-192、miR-194、miR-195、miR-203、miR-210、miR-214、miR-22、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-28、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30e、miR-338-3p、miR-497、miR-768-3p、miR-93)，包括表达差异17倍miR-142-5p和4.5倍miR-155;另外，有28条下调(miR101、miR-132、miR138、miR-139-5p、miR-181c、miR-186、miR-190、miR-191、miR-196a、miR-197、miR-30d、miR-32、miR-340、miR-34a、miR-345、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-424、miR-486-5p、miR-499-5p、miR-505、miR-532-3p、miR-590-5p、miR-744、miR-9、miR-93、miR-96、miR-99a)，其中miR-34a表达差异为4.9倍。

为进一步筛选miRNA芯片所得结果，笔者通过生物学方法对芯片所得的miRNAs的靶基因进行预测，所有靶标预测工具为:DIANA-microT(strict、loose、betaversion)，PicTar及TScan［11］。所得结果中与胃MALT淋巴瘤相关的miRNA有miR-142-3p、miR-142-5p、miR-138、miR-146、miR-155、miR-223、miR-34a、miR-378、miR-572及miR-93(表2)。

表2 胃MALT淋巴瘤组织中miRNAs表达情况

2.2 胃MALT淋巴瘤组织中m iR-142-5p及m iR-155表达

以其对应的非瘤正常胃组织为对照，结果胃MALT淋巴瘤组织miR-142-5p和miR-155表达情况见图1(因篇幅限制，本图仅列出21份标本结果)，其中位数分别为1.19和8.33。采用非参数秩和检验，胃MALT淋巴瘤组织中的miR-142-5p及miR-155表达显著高于相应正常胃黏膜(P＜0.01)(图1～3)。

图1 胃MALT淋巴瘤组织中m iR-142-5p和m iR-155表达情况

图2 21例胃MALT淋巴瘤组织及非瘤正常胃组织中m iR-155表达情况

图3 21例胃MALT淋巴瘤组织及非瘤正常胃组织中miR-142-5p表达情况

2.3 胃MALT淋巴瘤组织中m iR-142-5p表达与临床病理因素的关系

本研究结果显示，Hp感染阳性胃MALT淋巴瘤病例miR-142-5p相对表达量显著低于Hp感染阴性病例(0.65比1.29，P=0.022)，且较大肿瘤(≥5 cm)病例的miR-142-5p相对表达量显著高于小肿瘤(＜5 cm)病例(1.63比1.36，P=0.038)，肿瘤浸润深度超过肌层及全层病例的miR-142-5p表达显著高于肿瘤浸润局限于黏膜及黏膜下层病例(1.19比0.67，P=0.041)，且Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期组miR-142-5p相对表达量显著高于Ⅰ期病例(1.36比0.67，P=0.034)。但胃MALT淋巴瘤病例miR-142-5p相对表达量与年龄及性别无相关性(P＞0.05)。见表3。

表3 胃MALT淋巴瘤组织中miR-142-5p表达与临床病理因素的关系

2.4 胃MALT淋巴瘤组织中m iR-155表达与临床病理因素的关系

本研究结果显示，Hp感染阳性胃MALT淋巴瘤病例miR-155相对表达量显著低于Hp感染阴性病例(1.34比11.46，P=0.010)，且较大肿瘤(≥5 cm)病例的miR-155相对表达量显著低于小肿瘤(＜5 cm)病例(1.34比4.36)(P=0.048)，肿瘤浸润深度超过肌层及全层病例的miR-155表达显著高于肿瘤浸润局限于黏膜及黏膜下层病例(1.86比1.37，P=0.048)，且Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期组miR-155相对表达量显著高于Ⅰ期病例(13.90比1.81，P=0.009)。但胃MALT淋巴瘤病例miR-155相对表达量与年龄及性别无相关性(P＞0.05)。见表4。

表4 胃MALT淋巴瘤组织中m iR-155表达与临床病理因素的关系

3 讨论

胃MALT淋巴瘤属于低度恶性的肿瘤，早期MALT型淋巴瘤使用抗菌素能使70%的病例获得治愈，但随着疾病的进展可转化为高度恶性的弥漫性大细胞型B细胞淋巴瘤、Hp根除治疗抵抗性或肿瘤复发［1-3］。近年来研究发现miRNA在多种生物学过程中起着至关重要的作用，如细胞增殖、分化、凋亡等，且其表达异常在肿瘤发生发展过程中发挥类似于抑癌基因或癌基因的功能［7，11-12］。Robertus等［13］用qRT-PCR和原位杂交技术检测50例denovo DLBCL的15种miRNAs (miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-127、miR-155、miR-181a和miR-221)，结果发现miRNAs表达均定位于肿瘤细胞内，而背景细胞则无表达，尤其以miR-21及miR-19b表达最高。Lawrie等［14］报道12个miRNAs可准确预测＞85%病例的恶性转化DLBCL，6个miRNAs(miR-223、miR-217、miR-222、miR-221、let-7i、let-7b)可准确预测滤泡状淋巴瘤(FCL)的恶性转化(P＜0.05)，提示miRNAs可作为淋巴瘤的诊断和预后预测指标，也可作为DLBCL和FCL患者转化为高度恶性肿瘤风险评价指标。

Eis等［7］发现DLBCL等B细胞淋巴瘤中的miR-155拷贝数高出正常循环B细胞10%～30%，尤其激活的B细胞DLBCL，后者临床转归不佳。在B细胞淋巴瘤中，BIC基因编码的miR-155前体RNA出现10～30倍的蓄积现象;而在非霍奇金淋巴瘤中失表达。DLBCLmiR-155拷贝数是正常细胞的10～30倍。儿童Burkitt淋巴瘤患者的miR-155/BICRNA表达量高度增加，是其他儿童白血病的100倍，提示miR-155在B细胞淋巴瘤的发生中可能发挥重要作用。进一步研究发现活化B细胞型DLBCL的miR-155表达量明显高于生发中心型DLBCL，且前者预后较差，故认为miR-155表达可作为DCBCL诊断和预后判定的重要指标。Kluiver等［10］研究发现霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤中的BIC表达与miR-155水平一致，提示BIC可能为miR-155的前体。Lawrie等［14］通过检测DLBCL患者末梢血中miR-155、miR-210和miR-21，发现上述miRNAs表达明显高于对照组，且miR-21表达与DLBCL患者的无瘤生存期密切相关。孙冠星等［11］报道与正常对照组相比，miR-155在DLBCL中显著高表达，且miR-155在non-GCB型的表达明显高于GCB型，这提示对DLBCL的诊断分型有一定参考价值。本组资料表明Hp感染阳性胃MALT淋巴瘤病例miR-155相对表达量显著低于Hp感染阴性病例(1.34比11.46，P=0.010)，且较大肿瘤(≥5 cm)病例的miR-155相对表达量显著低于小肿瘤(＜5 cm)病例(1.34比4.36，P=0.048)，肿瘤浸润深度超过肌层及全程病例的miR-155表达显著高于肿瘤浸润局限于黏膜及黏膜下层病例(1.86比1.37，P= 0.048)，且Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期组miR-155相对表达量显著高于Ⅰ期病例(13.90比1.81，P=0.009)。但胃MALT淋巴瘤病例miR-155相对表达量与年龄及性别无相关性(P＞0.05)。

总之，胃MALT淋巴瘤组织与正常胃组织之间miRNAs表达差异显著，尤其是miR-142-5p及miR-155基因，且这两种基因表达与肿瘤大小、核分裂像及恶性程度等密切相关，提示miRNA在胃恶性淋巴瘤的发生发展过程中发挥重要作用。

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miR-142-5p and miR-155 expressions and their clinical significance in gastric MALT lymphoma tissue

ZHANG Zhijian1DING Ruliang1WANG Rongguo1LIN Xuejun1LIAO Nansheng1XU Xijuan1HAN Shaoliang2WU Xiuling2

1.Department of Gastrointestinal Surgery,the First People＇s Hospital of Taizhou,Zhejiang Province,Taizhou 318020, China;2.Department of Gastrointestinal Surgery,the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

ObjectiveTo screen miRNAs spectrum of gastric MALT lymphoma and investigate the relationship between miRNAs expression and the pathologo-biological behavior of gastric MALT lymphoma.Methods 47 cases of gastric MALT lymphoma were collected from the First People＇s Hospital of Taizhou and the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University between January 2003 to June 2013,and the miRNAs levels were detected in those surgical resected specimens paraffin,and the miR-142-5p and miR-155 expressions were compared with and their clinical significance.Results38 miRNAs,including miR-142-5p with 17 times and miR-155 with 4.5 times in gastric MALT lymphoma tissues,and 28 miRNAs down-regulated(including 4.9 times miR-34a)in these samples.The results revealed that miR-142-5p miR-155 expressions in gastric MALT lymphoma tissues were significantly higher than those in the corresponding normal mucosa(P＜0.01),the relative expression of miR-142-5p was significantly lower than that in Hp infection-negative(0.65 vs 1.29,P=0.022).Moreover,the relative expression of miR-142-5p in larger tumors (≥5 cm)was significantly higher than that in small tumors(＜5 cm)(1.63 vs 1.36,P=0.038),the miR-142-5p expression in tumor invasion deep above muscularwas significantly higher than that of tumor invasion limited to the mucosa and submucosa(1.19 vs 0.67,P=0.041),and the the relative expression of miR-142-5p in stageⅡ+Ⅲ+Ⅳgroup was significantly higher than that in stageⅠpatients(1.36 vs 0.67,P=0.034).Furthermore,the relative expression of miR-155 in positive Hp infection gastric MALT lymphoma was significantly lower than that in Hp infection-negative(1.34 vs 11.46,P=0.010),and the miR-155 relative expression level in larger tumors(≥5 cm)was significantly lower than that in small tumors(＜5 cm)(1.34 vs 4.36,P=0.048.In addition,the miR-155 expression in tumor-infiltrattion deeper than the muscle was significantly higher than that in the tumor invasion limited in the mucosa and submucosa(1.86 vs 1.37,P=0.048),and the relative expression of miR-155 in stage Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ group was significantly higher than that in stageⅠpatients(13.90 vs 1.81, P=0.009).ConclusionThe miRNAs expression between gastric MALT lymphoma tissue and normal gastric tissue are significantly different,especially miR-142-5p and miR-155 genes,and those expressions are correlated with tumor size,mitosis and malignant potential,this suggests that the miRNAs may play an important role in the development of gastric malignant lymphoma.

Gastric MALT lymphoma;miRNA;Biological behavior

R733.1

A

1673-7210(2015)03(a)-0058-06

2014-11-19本文编辑:卫轲)

浙江省台州市市级科技资金项目(编号121KY10)。

章志坚(1966-)，男，硕士，主任医师;研究方向:胃肠道肿瘤。