枫香树脂毒性及抑菌活性研究

陈朱辉，陈卫波，曾 韬*，沈徐标

1南京林业大学化学工程学院，南京 210037;2 南京大学医学院，南京 210093

中国枫香(Liquidambar formosanaHance)是枫香属中的一种，系金缕梅科枫香属植物，分布于我国秦岭及淮河以南各省，北起河南、山东，东至台湾，西至四川、云南及西藏，南至广东等地［1］。枫香树干在受到外界的机械损伤，昆虫及病原体的侵害等情况下可产生创伤性树脂道［2］，从而分泌出枫香脂(oleoresin of Chinese sweetgum，简称枫脂)。枫脂是我国特产的天然树脂和优良的药化产品。曾韬等研究了“V”字形下降法割沟采集枫脂的方法［3］，为促进我国枫脂生产提供了理论基础和实验参考。枫脂经过加工分离后，可制成液体枫香精油和固体枫香树脂［4］。吴维茜等［5］对枫香树脂的水蒸汽蒸馏浅色化工艺进行了研究，生产出质量较高的枫香树脂产品。枫香树脂淡黄色、透明、质松脆，其主要成分有肉桂酸肉桂酯，肉桂酸冰片脂，五环三萜醇、酮、酸及它们的酯类化合物［6-8］。这些化合物具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌等多种药理作用，是我国优良的传统中药材［9-11］。枫香树脂是一种新型的天然药化产品，目前正在开展相关应用研究，可望在药品、食品和工业助剂等方面具有良好的应用前景［12，13］。

为开发枫香树脂在食品、药品、食品级胶粘剂及食品级印刷油墨等方面的应用，需要对枫香树脂的相关生物活性和安全性进行评价。迄今，笔者尚未见有关枫香树脂毒性和抑菌活性等方面的研究报道。为此，本研究进行了枫香树脂对昆明小鼠的急性毒性和蓄积毒性和抑菌活性的实验。

1 材料与仪器

1.1 供试材料、动物及菌种

枫香树脂，广西产枫脂，经水蒸气蒸馏炼制［4］;六周龄雄性和雌性昆明小鼠［SCXK(苏)2005-0002］，南京大学医学院实验室提供;大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 8739)、金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC 6633)、假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens，ATCC 31554)、黑曲霉(Aspergillus niger，ATCC 10864)，供试菌种均由南京林业大学林产化工实验室提供。

1.2 试剂

DMSO(分析纯，南京化学试剂有限公司);苏木精(阿拉丁试剂公司);伊红(阿拉丁试剂公司);青霉素(哈药集团制药总厂);酮康唑(东京化成工业株式会社);丙酮(南京化学试剂有限公司)。

牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，用氢氧化钠调节pH 值为7。

土豆培养基(霉菌用):土豆(去皮切块)200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蒸馏水1000 mL，自然pH值。

1.3 仪器

JJ-500 型精密电子天平(美国双杰兄弟有限公司);生物显微镜(日本奥林巴斯公司);SP-300B 生化培养箱(南京恒裕设备有限公司);VS-1300L-U 超净工作台(苏州安泰设备有限公司);D-1 型自动蒸汽压力灭菌锅(北京发恩设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 毒性实验

2.1.1 急性毒性实验

取50 只小鼠按灌胃剂量随机分为5 组，分别为DMSO 对照组，2 g/kg 体重，4 g/kg 体重，8 g/kg 体重和16 g/kg 体重组，每组10 只，雌、雄各半。实验前小鼠禁食4 h，不禁水，对各剂量组进行灌胃针灌胃给药，给药后观察并且记录小鼠的外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物和死亡情况，连续观察14 d。对观察期满的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏做组织切片，HE 染色后做病理学检查。

2.1.2 胃排空实验

选取10 只小鼠，以16 g/kg 体重的剂量进行灌胃给药，实验前小鼠禁食4 h，不禁水，给药后每隔一段时间对一只小鼠进行解剖，观察枫香树脂在胃中的消化排空状态，并称量胃中残留枫香树脂的质量。

2.1.3 蓄积毒性实验

选取16 只小鼠，实验前小鼠禁食4 h，不禁水。分为实验组和对照组，每组8 只小鼠，雌雄各半。实验组给予5 g/kg 体重枫香树脂灌胃，每周二与周五各灌胃一次，连续8 周，记录小鼠的体重变化和行为改变。最后一次灌胃后一周处死小鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏做病理学检查。

2.2 抑菌活性测定

供试菌悬液的制备:在相对应的含有固体培养基的平板上，30 ℃的恒温培养箱中，细菌活化24 h，真菌活化72 h。用无菌接种环挑取生长良好的菌落充分分散于无菌水中，调至浓度为106～107CFU/mL，备用。

含菌平板的制备:将配置好的培养基倒入100 mL 锥形瓶中，每瓶75 mL，灭菌后冷却至50 ℃左右，在无菌工作台上，在每个锥形瓶中加入15 mL 的菌悬液，混匀后趁热向已灭菌的培养皿中倒入15 mL/皿培养基，冷却后即为含菌平板。

抑菌活性测定:采用纸片法，用打孔器制得直径为6 mm 的圆形滤纸片，灭菌后备用。配制浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078 mg/mL 的枫香树脂溶液(溶剂为丙酮)。用无菌移液枪吸取10 μL 枫香树脂溶液滴加在圆形滤纸片上，烘干后贴在含菌平板上，每个浓度做3 组平行实验，每皿贴滤纸片6 片。用滴加丙酮溶液的滤纸片做阴性对照，用滴加浓度为0.1 mg/mL 的青霉素水溶液的滤纸片为细菌抑菌的阳性对照，用滴加浓度为0.1 mg/mL 的酮康唑丙酮溶液的滤纸片为真菌抑菌的阳性对照。在30 ℃的恒温培养箱中，细菌培养24 h，真菌培养72 h。测量抑菌圈的直径，结果取平均值。

3 结果与分析

3.1 毒性实验

3.1.1 急性毒性实验

小鼠灌胃给药后，经14d 观察，记录小鼠的死亡情况，结果见下表1。

由表1 可知，所有剂量组的小鼠死亡率为0，无小鼠死亡。且14 d 内小鼠的外观、行为、对刺激的反应、分泌物及排泄物无异常。取其主要脏器做病理学检查中，小鼠的主要脏器组织切片的HE 染色结果见图1。由图1 可知，实验组与对照组相比，细胞排列紧密，细胞膜完整，没有炎症反应和细胞坏死，并没有明显的病理学变化。由此可以确定给小鼠灌服16 g/kg 的枫香树脂后，仍没有出现中毒死亡，即可以认为枫香树脂的LD50＞16 g/kg。按照毒理学的评价标准［14］，所用剂量显著高于5g/kg 体重的无毒安全剂量，这表明枫香树脂属于实际无毒类物质。

表1 急性毒性实验小鼠死亡率Table 1 Death rate of mouse in acute toxicity test

图1 急性毒性实验小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏石蜡切片HE 染色图Fig.1 Paraffin sections HE staining of heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in acute toxicity test

3.1.2 胃排空实验

枫香树脂的胃排空实验是为了观察枫香树脂在小鼠胃中能否正常消化排空以及排空所需时间，以16 g/kg 体重的剂量灌胃后的排空结果如下图2、3所示。

图2 为小鼠腹部解剖图，箭头所指的是残留枫香树脂的位置，其中左图是小鼠灌胃2 h 后的解剖图，可见小鼠的胃中有枫香树脂的残留，且小鼠小肠中也开始出现枫香树脂，说明枫香树脂已经开始被消化排泄。右图是小鼠灌胃16 h 后的腹部解剖图，其中小鼠胃中已无枫香树脂残留，只有结肠中有小块枫香树脂残留，说明枫香树脂已完全排空。

图2 小鼠腹部解剖图Fig.2 Mouse abdominal anatomy

图3 是小鼠胃内枫香树脂残留状况，由图中可以看出，随着时间的延长，小鼠胃中残留的枫香树脂量越来越少。结合图2 可知，在灌胃16 h 后，枫香树脂完全排空。由此可以说明枫香树脂在小鼠胃中会随着时间慢慢消化排出，不会在胃中积留，可完全排空。

图3 小鼠胃内枫香树脂残留状况Fig.3 Residual properties of Chinese sweetgum resin in mice stomach

3.1.3 蓄积毒性实验

经过9 周的实验和观察，两组中所有小鼠均未出现死亡现象，小鼠的外观、行为、对刺激的反应、分泌物及排泄物均无异常。在9 周的实验期间，小鼠的体重变化见图4 所示。

图4 小鼠体重变化Fig.4 Changes of mice body weight

由图4 可知，实验组小鼠的体重与对照组小鼠无明显差异，说明给小鼠灌服枫香树脂并未影响小鼠的正常生长。主要脏器的组织切片HE 染色结果见图5 所示，实验组与对照组相比，实验组各脏器细胞未出现明显的空泡化，细胞排列紧密，细胞膜完整，未见细胞坏死，未见炎症反应，并没有明显的病理学变化。可以说明枫香树脂对小鼠无明显的蓄积毒性作用。

图5 蓄积毒性实验小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏石蜡切片HE 染色图Fig.5 Paraffin sections HE staining of the heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in accumulative toxicity test

3.2 抑菌活性实验

采用滤纸片法研究枫香树脂的抑菌活性，其结果由表2 和图6 可见，枫香树脂对4 种细菌均有抑制作用，但对黑曲霉却没有抑菌效果。在4 种细菌中，对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用较强，在10 mg/mL 浓度的抑菌圈直径分别为20.3 mm 和18.6 mm，表明其对革兰氏阳性菌有较好的抑制效果;对大肠杆菌和假单胞杆菌的抑制作用相对较弱，在10 mg/mL 浓度的抑菌圈直径分别为12.4 mm 和13.1 mm，表明其对革兰氏阴性菌的抑制效果较弱。

由表2 还可看出，随着枫香树脂的浓度降低，对细菌的抑制能力也随之减弱，可知枫香树脂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞杆菌、枯草杆菌各受试菌的最小抑制浓度(MIC)分别是0.156、0.3125、0.625、0.3125 mg/mL。

表2 不同浓度的枫香树脂的抑菌活性Table 2 Bacteriostatic activity of different concentrations of Chinese sweetgum resin

图6 枫香树脂对四种细菌的抑菌圈Fig.6 Inhibitory zone of Chinese sweetgum resin against 4 bacteria

4 讨论与结论

急性毒性和蓄积毒性实验是评价外源物质安全性的重要指标。急性毒性实验是药物毒理学安全性评价的第一步，具有了解受试物急性毒性强弱的作用。LD50是评价受试物急性毒性强弱以及比较其急性毒性大小的一个常用指标。LD50数值越大，则表明受试物急性毒性越弱、越小;反之，急性毒性就越强、越大。本实验测定枫香树脂对小鼠的LD50＞16 g/kg，根据毒理学评价标准［14］，枫香树脂属于实际无毒物质。

外源物质在机体内所产生的蓄积作用是引起亚慢性毒性作用和慢性毒性作用的基础。人们在外源物质毒理学评定的实际工作中，可根据受试物的蓄积毒性强弱作为评估它的毒性作用指标之一，也是制定卫生标准时选用安全系数大小的重要参考依据。本实验以5 g/kg 体重的剂量长时间给小鼠灌服后，未见小鼠出现死亡，与对照组相比，小鼠可以正常生长，平均体重的增加和重要脏器的病理学检查均未见差异，说明枫香树脂在小鼠体内无蓄积毒性。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉等对食品卫生、临床医学和一些生物材料具有严重的危害和影响。枫香树脂作为一种天然植物资源，对上述细菌都有不同程度的抑制作用，MIC 值分别为0.3125(大肠杆菌)、1.25(假单胞杆菌)、0.156 mg/mL(金黄色葡萄球菌)和0.3125 mg/mL(枯草芽孢杆菌)。

由上述实验结果，可以初步判定枫香树脂在相关药、食产品方面的使用是安全的。本实验研究为今后更进一步的毒理学研究及相关药、食产品的开发应用提供了科学依据。

1 Zhang HD (张宏达).Flora of China (中国植物志).Beijing:Science Press，1979.55.

2 Zeng T (曾韬)，Song X (宋晓)，Zeng C (曾诚).Study on the methods of the tapping from Chinese sweet gum.China For Sci Tech(林业科技开发)，2010，24:84-87.

3 Zeng T (曾韬)，Song X (宋晓)，Zeng C (曾诚).A method of collection of oleoresin of Chinese sweetgum (一种采集枫香脂的方法).ZL201010617196.0.

4 Song X (宋晓)，Zeng T (曾韬).Study on process of steam distillation of Chinese sweetgum resin.Bio Chem Eng(生物质化学工程)，2010，44(6):10-13.

5 Wu WQ (吴维茜)，Song X (宋晓)，Zeng T (曾韬)，et al.Study on process of decolorization of Chinese sweetgum resin.China For Sci Tech(林业科技开发)，2013，27:105-107.

6 Yonkov LK，Ivanov CP，Fam TT，Comptes Rendus de Academie Bulgare des Sciences (Dakl.Bolg.Akad.Nauk.)1980，75:33.

7 Liu C (刘驰)，Xu JF (徐金富)，He QM (何其敏)，et al.Chemical components of theLiquidambar formosanaH.resin.Org Chem(有机化学)，1991，11:508-510.

8 Wu WQ (吴维茜).Study on technology of decolorization component analysis of Chinese sweetgum resin.Nanjing:Nanjing Forestry University (南京林业大学)，MSc.2013.

9 Shan JZ，Xuan YY，Zheng S，et al.Ursolic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibiting the EGFR/MAPK pathway.Zhejiang Univ Sci B，2009 10:668-674.

10 Zhang PX，Li HM，Chen D，et al.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activa?tion and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39:803-809.

11 Saraswati S，Agrawal SS，Alhaider AA，et al.Ursolic acid inhibits tumor angiogenesis and induces apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in Ehrlich ascites carcinoma tumor.Chem-Biol Inter，2013，206:153-165.

12 Xing ZZ (邢珍珍)，Wu WQ (吴维茜)，Zeng T (曾韬).Tackifying effect of sweetgum resin in SIS hot melt adhesive.Chem Ind For Prod(林产化学与工业)，2014，34(2):51-55.

13 Xing ZZ (邢珍珍)，Chen ZH (陈朱辉)，Zeng T (曾韬).Study on preparation of Chinese sweetgum resin/ acrylate composite emulsion and properties of the pressure sensitive adhesive.J Fujian For Sci Tech(福建林业科技)，2014，41(3):94-99.

14 Shen JZ (沈建忠).Animal Toxicology (动物毒理学).Beijing:China Agriculture Publishing House，2002.83-102.