关中黑猪精液常温保存研究

陈晓畅，宋学太，王师哲，胡建宏，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌712100）

关中黑猪顾名思义，因其产地在陕西省关中平原而得名，是我国早期培育成功的肉脂兼用型优良品种之一，主要分布在陕西关中平原的咸阳、兴平、周至、武功、杨凌等地区。目前，由于市场变化，在其育种上没有采用更好的方法，致使关中黑猪原来的优良性状在不断退化，因而对关中黑猪精液的常温保存的研究就很有意义。

目前，由于猪精液的冷冻保存技术仍然不够完善，存在生产难度大，活率低，受胎率低及产仔少等诸多问题。因此，猪的精液保存普遍应用的方法仍然是常温保存。然而，我国大多数猪场采用的稀释液均是自配稀释液，在常温条件下保存的有效时间一般仅为2～3d，且在保存48h后其活力就会明显下降，严重地影响了猪的受精率和受胎率。因此，本试验旨在通过不同添加物质、不同温度、不同抗生素之间的对比试验，筛选出保存效果好的稀释液配方，从而延长精子存活时间，提高精子的存活率和受精率，为今后的关中黑猪的育种工作提供第一手数据。

1 材料与方法

1.1 精液来源

试验精液来源于西北农林科技大学家畜生态养殖场健康成年的关中黑猪种公猪。精液采集方法为手握法采精，精液采集后静置并收集中段浓缩部分，采用4层医用纱布进行过滤，并保存于保温杯中。30min内带回实验室，立即在37 ℃条件下在显微镜下进行观测精子活力、密度。选择色泽和气味正常，且精子活力在0.7以上，密度在2×108～4×108个／mL的精液进行试验研究。

1.2 主要仪器和设备

温度计、显微镜、血细胞计数板、冰箱、容量瓶、烧杯、载玻片、盖玻片、试管、称量纸、药勺、毛巾恒温水浴锅、计数器、移液枪、电子天平、37 ℃恒温板、pH 试纸、镊子、青霉素小瓶、滴管、注射器（1 mL、2 mL、5mL、10mL）、玻璃棒等。

1.3 精液常温保存稀释液配方选择

根据已有文献报道，本试验设计了如下5种稀释液配方，见表1。

表1 稀释剂配方的比较 g／L

1.4 精液常温保存温度的选择

根据试验结果，选取表1中保存效果最佳的稀释液配方，分4组不同的温度对关中黑猪精液常温保存效果进行对比，其温度分别为10 ℃、15 ℃、20℃、25 ℃。精液与稀释液按1：1比例稀释，抗生素在稀释前添加。

1.5 精液常温保存抗生素的选择

根据试验结果，选取表1中保存效果最佳的稀释液配方，在同温同稀释比例的条件下，分别选用青霉素、庆大霉素、青霉素＋庆大霉素三种抗生素进行关中黑猪精液保存效果对比，并设置不添加抗生素的一组作为对照。

1.6 稀释液的配制及精液的稀释保存

按配方准确称量药品，按不同组别将不同种类及浓度的药物加入到基础配方液中，用玻璃棒混匀使之充分溶解，抽滤，并在37℃水浴箱中预热，将稀释液按不同组别分装在小瓶中。根据原精密度按0.3～0.5亿个／mL的标准确定其稀释倍数，将猪精液沿壁倒入小瓶中，轻轻摇匀，密封后将小瓶室温放置2h后放入17 ℃恒温保存箱中保存，每隔12h轻轻摇动精液1次。每隔12h检测精子各项指标，直至精子活力低于0.50。

1.7 稀释液及评定指标

1.7.1 鲜精精液品质评定指标 颜色、气味、活率、密度、畸形率。

1.7.2 精子活力的检测 在37 ℃加热的载物台上，分别从5个锥形瓶中用移液枪取30μL，滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，其间充满精液，不存留气泡。置于显微镜下，放大400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，并在暗视野中观察。

2 结果与分析

2.1 关中黑猪新鲜精液品质测定

关中黑猪精液品质基本稳定，品质符合要求。采精量平均为250mL，颜色为乳白色，pH7.3，密度2.36亿个／mL，活力0.85，畸形率为16%，质膜完整性为79%。

2.2 不同稀释液对关中黑猪精子活力的影响

通过5种稀释液的稀释，每隔12h检测一次活力，不同稀释液作用下精子活力随时间变化明显，有效天数为精子活力在0.5以上的天数，不同稀释剂对精子活力影响见表2。

表2 不同稀释液对精子活力的影响

由表2可知，在5种稀释液中，有效保存效果最好的是Ⅲ，有效保存时间为5.0d，明显好于Ⅰ（P＜0.05），而Ⅰ的保存效果好于其余三种（P＜0.05）。Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三种稀释液有效保存时间2.0～2.5d，保存效果相似（P＞0.05）。当选择短期保存精液时（2.0d内），Ⅰ、Ⅲ两种稀释剂的保存效果近似（P＞0.05），Ⅲ略好。如果稍长时间保存则可选择Ⅲ号稀释剂（P＜0.05）。

2.3 不同温度对关中黑猪精子活力的影响

不同温度对关中黑猪精子活力的影响见表3。

表3 同种稀释液在不同温度下的精子活力

由表3可知，关中黑猪的精液在Ⅲ号稀释液按1∶1比例稀释保存时，15 ℃、20 ℃温度条件下的精子活力略好于在10 ℃、25 ℃温度条件下的保存结果（P＞0.05）。在15℃、20℃温度条件下的精子活力无明显差别（P＞0.05），总体上看15 ℃条件下的精子活力略高。因此，关中黑猪精液常温保存最佳温度为15 ℃～20 ℃（P＞0.05）。

2.4 不同抗生素对关中黑猪精子活力的影响

不同抗生素对关中黑猪精子活力的影响见表4。

表4 不同抗生素对精子活力的影响

由表4可知，在稀释液中加入青霉素、庆大霉素及青霉素＋庆大霉素的混合液对关中黑猪精液常温保存效果并无明显差异（P＞0.05）。但在稀释液中不添加抗生素，1.5d后精子活力会急剧下降到0.5（P＜0.05）。

3 讨论

猪精液常温保存技术是猪人工受精技术中常用的方法，而稀释液是影响猪精液常温保存效果的关键因素。稀释液的主要作用一方面用于扩大精液体积以满足生产需求，另一方面保护精子的功能特征，维持精子的受精能力。稀释液中所含的各种成分对精子的保护作用也各不相同。本研究发现，在选用的5种稀释液中，对关中黑猪精子保存效果Ⅲ号稀释液最好，可保存5d，精子活力0.5以上。因此，Ⅲ号稀释液配方中葡萄糖、柠檬酸钠、EDTA、碳酸氢钠、柠檬酸和Tris配比较合理。

在影响精子存活的外界环境因素中，保存温度至关重要。早期对于精液常温保存的适宜温度的研究中发现，低温可以抑制精子的活性，从而达到延长保存时间的目的。而大量的研究表明，低温会导致精子细胞失活。最近研究表明，在15 ℃～20 ℃条件下，对于猪精液的保存效果最好，其中普遍认可的是17℃室温条件是精液常温保存最好的温度。在这一温度区间内，精子活动受到抑制，而又不会影响其活性，关中黑猪常温保存的最佳温度为15℃～20℃。

抗生素的添加是猪精液常温保存过程中的重点，抗生素的作用是抑制稀释液中细菌的滋生，为精子细胞提供健康环境。本试验的结果表明，青霉素、庆大霉素和青霉素＋庆大霉素的混合剂组间的效果差异不显著。抗生素研究现在所面临的问题是，由于抗生素的滥用，使得细菌对于常规抗生素有了明显的抗性，使得抗生素的作用受损。在以后的研究中，应针对于猪精液常温保存的过程中稀释液中滋生细菌的种类，探索出有针对性的抗生素来解决这一问题。

4 结论

关中黑猪精液常温保存效果最佳的是Ⅲ号，常温保存的最佳温度为15 ℃～20 ℃。

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