丝素肽的制备及其抗氧化活性研究

谷平平，李琳琳，娄小平*，金 歌

1 郑州大学第一附属医院，郑州 450000;2 许昌陶瓷职业学院，禹州 461670

丝素蛋白由于其结构致密，溶解性差，导致其虽然具有良好的营养价值，但难以被人体所吸收，利用程度较低，故通常需将丝素蛋白进行水解，降解成具有独特的生理活性和药用价值的多肽类物质。根据新天丝生物技术有限公司的报道，经硫酸化处理过的丝素蛋白水解产物可以被制成抗凝药剂，经抗血液凝固活性试验，发现它像肝素一样，具有抗血液凝固活性，可替代肝素广泛的应用于如尿毒症病人人工透析或体外循环时血液中的抗凝剂。Rhee SK 等曾将丝素蛋白水解后的产物分别配成0.3%、0.6%、0.9%的浓度，加入到泡菜中，结果表明，对乳酸菌的生长有显著抑制作用，证明丝素肽具有抗菌作用。丝素肽具有良好的吸收机制，并具有一些不可比拟的生理功能，如降血糖作用、降胆固醇作用、抗氧化作用、改善肠道生理功能、防止脑老化和冷冻保护作用等，因此丝素在功能性食品、化妆品及医药等多个领域具有很高的开发价值。本文对丝素肽的抗氧化活性进行了探索研究，为将丝素肽开发为功能性食品或食品添加剂奠定理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与主要试剂

废蚕丝:农户处购买;碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)3.11×107 U/g，丹麦诺维信酶制剂公司，食品级。NaOH，邻苯三酚，乙醇，水杨酸，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 主要仪器

半自动凯氏定氮仪，HR-500，上海华睿仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 水解度(DH)的测定

采用pH-stat 法［1］测定丝素蛋白的水解度，计算公式如下所示。

式中:B:消耗的NaOH 量(mL);Nb:NaOH 摩尔浓度;ɑ=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pK 为氨基酸的平均pK，按7.0 算(平均解离常数);pH 为反应起始pH 值;α:α-氨基酸的平均解离度;htot:每克丝素蛋白中肽键的mmol 数(mmol/g)，对于丝素蛋白h=12.4 mmol/g;m:蛋白质总量。

2.2 碱性蛋白酶降解丝素蛋白的单因素实验

碱性蛋白酶Alcalase2.4 L 所能作用的肽键的范围较宽，并对结晶区中由丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸参与形成的肽键有特异性，所以能使丝素更大程度地水解［2-5］，因此，本试验选用碱性蛋白酶作为水解用酶。

在酶解反应中，为了使酶解反应能充分进行，需要筛选合适的酶解条件，从而使酶显示出足够的催化活性。影响酶解效果的因素主要有底物浓度、加酶量、pH 值、温度和时间。因此，本实验对这五个因素进行了单因素实验，即在加酶量为2%、pH 为8.5，反应温度为55 ℃，反应时间为4 h 的条件下，分别设定底物浓度为2%、3%、4%、5%、6%、7%对丝素蛋白进行酶解，并测定其水解度;在底物浓度为5%，pH 为8.5，温度为55 ℃，反应时间为4 h 的条件下，分别以加酶量1.0%、1.5%、2%、2.5%、3.0%、3.5%对丝素蛋白进行酶解，并测定其水解度;在加酶量为2.0%、底物浓度为5%，温度为60℃，反应时间为4 h 时，参考碱性蛋白酶的最适作用条件，分别在pH 为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 对丝素蛋白进行酶解，并测定其水解度;酶促反应受温度影响较大，酶解温度太低，蛋白酶不易激活，反应速度较慢，温度过高则会引起酶蛋白变性失活，因此，在加酶量为2.0%、底物浓度为5%，pH 为8.5，反应时间为4 h 时，分别以温度为45、50、55、60、65 ℃对丝素蛋白进行酶解反应，并测定其水解度;在加酶量为2%、底物浓度为5%，pH 为8.5，温度为55 ℃时，分别在1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5 h 时测定其水解度。

2.3 碱性蛋白酶降解丝素蛋白的正交实验

通过碱性蛋白酶水解丝素蛋白的单因素实验，选定合适的正交试验的因素水平，进一步优化酶解条件，得出丝素蛋白的最佳酶解工艺条件，正交实验因素水平表如表1 所示。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Table 1 Levels and factors of the L9(33)orthogonal test

将一定浓度的底物与酶在恒温摇床中进行反应，不断加入0.5 mol/L NaOH，从而使反应体系的pH 值保持在试验规定的范围内，用pH-stat 法测定水解度。水解反应终止时煮沸10 min 进行灭酶［6-9］。冷却后，酶解液以10000 rpm 的速度离心20 min，除去蛋白酶及未水解完全的丝素蛋白，取上清液浓缩得到丝素肽产物。

2.4 抗氧化活性的测定

式中:A0为空白对照液的吸光值;Ax 为加入水解液后的吸光值。

2.4.2 丝素肽清除羟基自由基(·OH)能力的测定

Fe2+与H2O2混合产生·OH，加入水杨酸可捕捉·OH，并产生有色物质，该物质在510 nm 下有特征吸收。根据此原理，在反应体系中依次加入0.2 mol/L 的磷酸缓冲液(pH 为7.4)6 mL，10 mmol/L的水杨酸1 mL，3.8 mmol/mL FeSO4-EDTA(1∶1)1 mL，然后加入10 g/L 的水解产物2 mL，最后加入2 mL 8 mmol/L H2O2启动反应。以2 mL 去离子水代替水解产物作为对照组，37 ℃条件下水浴恒温60 min，之后加入2 mL 6 mol/L HCl 终止反应［12］，在510 nm 测定吸光值。经测定得出不同水解度下的产物对·OH 的清除率。

式中:A0为空白对照液的吸光值;Ax 为加入水解液后的吸光值。

2.4.3 丝素肽清除二苯代苦味酰基(DPPH·)能力的测定

二苯代苦味酰基(DPPH·)法是一种广泛应用于筛选抗氧化剂的方法，其主要是因为DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517 nm 附近有强吸收(乙醇溶液呈紫色)。当有自由基清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度可评价自由基清除剂的活性。

用无水乙醇配制1 mmol/L 的DPPH 溶液，冰箱避光保存，将2 mL 蒸馏水与2 mL 1 mmol/L 的DPPH·乙醇溶液加入同一试管中，摇匀，放置30 min，于517 nm 处测定其吸光A0，即为空白对照液的吸光值，测定样品清除能力时，2 mL 浓度为10 g/L 的丝素肽样品与2 mL 1 mmol/L 的DPPH·乙醇溶液混匀于试管中，静置30 min 后，5000 rpm 离心5 min［13］，取上清液测定其吸光度Ax，即为丝素肽样液的吸光值，同时测定丝素蛋白水解溶液与2 mL 无水乙醇混合后的吸光度Ax。经测定得出不同水解度下的产物对DPPH·的清除率，清除率越高表明抗氧化越强。

式中:A0为空白对照液的吸光值;Ax为加入水解液后的吸光值。

3 结果与分析

3.1 碱性蛋白酶的单因素实验结果分析

碱性蛋白酶Alcalase 是NOVO 酶制剂公司产品，在我国被广泛应用于丝绸、皮革、食品和医药工业以及生物技术领域，具有很高的水解蛋白质能力［14-16］。

由图1 是各因素对丝素蛋白水解度的影响曲线，由图1 可知当底物浓度在2%～5%之间时，随着底物浓度的增加，水解度不断提高;超过5%时水解度开始下降。因此本实验选用的底物浓度的水平范围为3%、4%、5%。随着加酶量的增加，水解度逐渐提高，即酶解效果越好;但是，当加酶量超过2.5%时，碱性蛋白酶催化水解丝素蛋白的水解度变化幅度较小，基本达到平衡状态，即水解度的提高并不与加酶量同倍增加，故选用的加酶量的水平范围为1.5%、2.0%、2.5%。随着pH 由7.5 增大至8.5，曲线变化幅度较大，碱性蛋白酶催化丝素蛋白的水解度明显增大，在pH 为8.5 时其水解度最大;当pH 超过8.5 后，曲线呈下降趋势，但pH 为9 时的水解度依旧高于pH 为7.5 和8 的。故本实验选用的pH 值水平为8、8.5、9。该反应的水解度随着温度上升而增加，当温度为60 ℃时，反应DH 达到最大值22%，继续提高反应温度反而会降低反应的DH 值，这可能是Alcalase 酶在高温下变性，从而导致酶催化活性减弱，不利于酶解反应的进行所致。在水解1～4 h 内，曲线的变化幅度较大。继续水解时，曲线的变化幅度明显变小，说明水解程度增加幅度减小。这可能是因为作用4 h 后，碱性蛋白酶Alcalase2.4 L 的底物水解已接近平衡，故本实验最终选择3.5、4.0、4.5 h 作为碱性蛋白酶水解丝素蛋白的水平范围。

3.2 碱性蛋白酶催化丝素蛋白水解反应的正交实验结果分析

根据单因素实验结果，选取的温度、加酶量、底物浓度、pH、反应时间五个因素中，由于温度对实验结果影响较小，故正交试验以水解度为指标，选取底物浓度、pH 值、加酶量、时间四个因素进行设计，每个因素选取三个水平，实验结果见表2。

图1 底物浓度(A)、加酶量(B)、pH(C)、水解温度(D)及反应时间(E)对丝素蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of substrate concentration(A)，enzyme dosage(B)，pH(C)，reaction temperature(D)and reaction time(E)on degree of hydrolysis of silk fibroin

表2 L9(34)正交实验及结果Table 2 Results of the L9(34)orthogonal test

由上表可知，四个因素对水解度的影响顺序依次为:底物浓度＞加酶量＞pH 值＞酶解时间。最优方案为A2B3C2D2，即加酶量为2%，酶解时间为4.0 h，底物浓度为5%，pH 值为8.5，反应温度为60 ℃，在此条件下，水解度达到最大值，可达23.92%。

3.3 丝素肽的抗氧化活性结果分析

图2 是不同水解度条件下的的丝素蛋白水解产物对超氧自由基、·OH 及DPPH·清除能力曲线，由图2 可知未酶解的丝素蛋白基本没有清除超氧自由基的能力，但经酶解的丝素肽却表现出不同程度的清除超氧自由基的能力，由此可知酶解丝素蛋白有利于丝素蛋白的抗氧化活性的发挥。未酶解的丝素蛋白虽然具有一定的清除·OH 的能力，但清除能力较弱。经酶解的水解产物表现出不同程度的清除·OH 的能力都明显高于未水解的丝素蛋白，由此表明酶解丝素蛋白有利于丝素蛋白的抗氧化活性的充分发挥。未酶解的丝素蛋白基本没有清除DPPH·的能力，即没有抗氧化活性。经酶降解后的的丝素肽表现出不同程度的清除DPPH·的能力，由此可知丝素蛋白只有被酶降解后才能表现出其抗氧化活性，在碱性蛋白酶Alcalase2.4 L 作用下，丝素肽清除DPPH·的能力随水解度的提高而不断增强，但其清除能力与水解度之间并非简单的线性关系。

图2 不同水解度的丝素肽对超氧自由基(A)、·OH(B)、DPPH·(C)的清除能力Fig.2 Scavenging effects of different degrees of silk fibroin peptides on superoxide anion free radical，·OH and DPPH·

4 结论

通过实验可以发现，丝素肽水解液具有一定的抗氧化能力，其中不同水解度的丝素肽的抗氧化能力有所差异。一定范围内，丝素肽的抗氧化能力随着水解度的增加而增大，但并非是简单的线性关系，本实验中我们可知丝素肽在水解度为23.92%时其抗氧化性达到最大。

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