小鼠日本血吸虫病肝纤维化模型构建*

张丽君，沈定文

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

小鼠感染日本血吸虫后，其肝脏自然病变过程与日本血吸虫病患者有着极大的相似性［1］，因此，构建稳定的小鼠日本血吸虫病肝纤维化模型对于研究人类日本血吸虫病肝纤维化的形成、发展机制以及药物的治疗具有重要意义。本实验通过构建稳定的日本血吸虫病小鼠肝纤维化模型，观察小鼠日本血吸虫病肝纤维化形成、发展的动态病理过程，为探讨日本血吸虫病肝纤维化发病机制和药物干预实验用药时机的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和钉螺 昆明小鼠，雄性，体质量18～22g，购自湖北省疾病预防控制中心血吸虫病防治研究所。阳性钉螺，购自湖北省疾病预防控制中心。

1.2 动物造模与取材 昆明小鼠50 只，随机分为A(对照组)、B(6 周组)、C(8 周组)、D(10 周组)和E(12 周组)。实验组每只小鼠采用尾蚴敷贴法经皮肤感染血吸虫尾蚴(20 ±1)条，对照组以不含尾蚴的去氯水进行处理。日本血吸虫感染后第6 周、第8 周、第10 周、第12 周，分别处死相应小组小鼠进行取材，取材前禁食12h，对照组与12周组同时取材。取材前编号称重并记录。动物麻醉后，剥离肝脏，生理盐水洗去粘附的血液后，用滤纸吸去多余液体，称量肝脏重量并记录。分离出的肝脏置入4%甲醛中固定，24h 后进行脱水透明、石蜡包埋。

1.3 观察指标 肝脏指数按照下面公式计算:肝脏指数(%)=肝脏重量(g)/体重(g)×100%。HE 染色和Masson 染色观察各实验组小鼠肝损伤程度和胶原纤维沉积情况。

2 结果

2.1 肝脏指数 与对照组比较，感染后不同时期小鼠肝脏指数都显著升高(P ＜0.01)，见表1。

表1 小鼠感染日本血吸虫尾蚴后不同时期肝脏指数的比较()

表1 小鼠感染日本血吸虫尾蚴后不同时期肝脏指数的比较()

与A组比较，* P ＜0.001

2.2 病理学检查 HE 染色结果小鼠感染日本血吸虫6 周后，急性虫卵肉芽肿形成，肉芽肿周围有嗜酸性粒细胞为主的各种炎性细胞浸润;而感染12 周后，虫卵肉芽肿体积缩小，肉芽肿周围浸润的炎性细胞有所减少，周围变性、坏死的肝细胞数量增多，见图1(封二)。Masson 染色结果感染6周后，虫卵肉芽肿内可见少量被染成蓝色的胶原纤维。随着感染的发展，胶原纤维逐渐增多并且汇及汇管区，感染12 周后，胶原纤维连接成片，并延伸至肝窦壁，见图2(封二)。结果表明小鼠感染日本血吸虫6 周后，肝组织有肉芽肿形成和胶原纤维沉积，感染12 周后，肝纤维化特征明显。

3 讨论

目前仍没有能够直接逆转血吸虫病肝纤维化的药物和治疗方法，所以，进一步的研究工作仍要继续。动物模型，尤其是小鼠血吸虫病模型是这一领域研究的重要基石［2］，小鼠肝脏在感染日本血吸虫后发生的病理变化与人类日本血吸虫病表现出极大的相似性，此模型能够较为准确的再现人类日本血吸虫病肝纤维化发病的自然过程，无疑是目前研究日本血吸虫病肝纤维化发病机制以及研究开发抗血吸虫病肝纤维化药物的较为理想的实验动物模型。各国学者应用这一模型对血吸虫病进行的多方面的研究，包括组织生物学、病理学、药理学、免疫学、药物筛选和疫苗开发等。

日本血吸虫尾蚴经皮肤感染进入小鼠体内，同时断尾转变为童虫，童虫在宿主体内移行、生长发育为成虫，最后寄居于小鼠门静脉-肠系膜静脉系统中。成虫除了会对机体造成一些机械损伤外一般无明显的致病作用，但它所产生的虫卵经门静脉沉积肝脏会对宿主产生严重的病理损害。日本血吸虫尾蚴一般在感染宿主24d 后可发育为成虫开始产卵，4 周后开始沉积肝脏，但此时的未成熟的虫卵并没有抗原活性，要经过大约11d 的时间发育为成熟的虫卵才具有抗原活性，成熟的虫卵可释放SEA 到周围组织中，经APC 处理并呈递给辅助性T 细胞(Th)，致敏的Th 再次受到相同的抗原刺激后，可产生释放多种淋巴因子，引起以巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、MFB 等细胞聚集为特征的炎症肉芽肿性反应。血吸虫病肝纤维化就是在虫卵肉芽肿的基础上逐渐发展形成的［3～5］。虫卵肉芽肿的大小、数量与血吸虫病病理损害的严重程度有着直接的关系。虫卵肉芽肿的形成是宿主对虫卵的一种免疫应答［6，7］。一方面，它可相对延长宿主的生命，隔离和清除SEA，使宿主不过早死亡;另一方面，宿主正常的组织结构被不断生成的虫卵肉芽肿破坏，并相互连接形成疤痕，导致肝纤维化甚至肝硬化。同时，随着病情的发展，肝内广泛分布的虫卵破裂或钙化，刺激周围类上皮细胞逐渐演变为成纤维细胞，分泌大量胶原纤维，进一步加重肝纤维化。

本实验通过构建稳定的日本血吸虫病肝纤维化的疾病模型，观察昆明小鼠在感染日本血吸虫尾蚴后，肝脏组织随时间而发生病理改变。结果小鼠感染日本血吸虫6 周后，急性虫卵肉芽肿内有少量胶原纤维。感染8 周，虫卵肉芽肿周围有明显的胶原纤维沉积。感染12 周，肉芽肿病灶周围出现明显的肝纤维化特征。随着病程发展，小鼠肝脏组织的肝纤维化程度呈进行性加重，胶原纤维含量也逐渐增加，且胶原沉积部位与虫卵肉芽肿位置密切相关。结果表明小鼠感染日本血吸虫6 周后，肝组织有肉芽肿形成和胶原纤维沉积，可作为药物干预实验开始用药时机的标志。

［1］张彬彬，蔡卫民，陶君，等.吡喹酮联合γ-干扰素治疗对日本血吸虫性肝纤维化小鼠Smads 蛋白表达的影响［J］.Chinese Hepatology，2014，19(5):356

［2］Abdul-Ghani RA，Hassan AA.Murine schistosomiasis as a model for human schistosomiasis mansoni:similarities and discrepancies［J］.Parasitol Res，2010，107(1):1

［3］Friedman SL.Hepatic fibrosis-overview［J］.Toxicology，2008，254(3):120

［4］Bartley PB，Ramm GA，Jones MK，et al.A contributory role for activated hepatic stellate cells in the dynamics of schistosoma japonicum egg induced fibrosis［J］.Int J Parasitol，2006，36(9):993

［5］Chang D，Ramalho LN，Ramalho FS，et al.Hepatic stellate cells in human schistosomiasis mansoni:acomparative immunohisto-chemical study with liver cirrhosis［J］.Acta Trop，2006，97(3):318

［6］Burke ML，Jones MK，Gobert GN，et al.Immunopathogenesis of human schistosomiasis［J］.Parasite Immunol，2009，31(4):163

［7］Burke ML，McGarvey L，McSorley HJ，et al.Migrating Schistosoma japonicum schistosomula induce an innate immune response and wound healing in the murine lung［J］.Mol Immunol，2011，49(1-2):191