CALR基因突变在骨髓增殖性肿瘤中的临床研究

王彦丽 戚光祖 郭洪娜 接贵涛 范美英

山东省临沂市沂水中心医院血液科，山东临沂 276400

BCR/ABL1 融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative meoplasm，MPN）是一组起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤，表现为骨髓细胞一系或多系过度增殖， 包括真性红细胞增多症（polycythemia，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocthemia，ET）、原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF），临床上有发生动静脉血栓、髓外造血、骨髓纤维化、甚至向白血病转化[1-2]。 JAK2V617F 突变见于97%的PV，50%～60%的ET 及PMF 患者[3]。MPL515 基因突变可见于3%～5%的JAK2V617F 突变阴性的ET 及PMF 患者[4]。 自2005 年JAK2V617F 和MPL515 突变相继被发现并纳入WHO 诊断标准，该突变的发现改变了MPN 的诊断和分类，从分子的角度诠释了MPN的发病机制。但仍有40%的ET 及PMF 患者未检测到JAK2V617F 基因突变， 最近研究发现CALR 见于JAK2V617F 阴性的ET 及PMF 患者， 本研究对临床初诊MPN 患者进行了JAK2V617F、CALR 及MPL515基因突变分析，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012 年1 月～2015 年3 月在临沂市沂水中心医院就诊的72 例初诊MPN 患者。其中PV23例，男11 例，女12 例，年龄38～72 岁；ET26 例，男12例，女14 例，年龄25～80 岁；PMF23 例，男16 例，女7例，年龄39～76 岁。所有患者均经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。

1.2 检验指标

对患者临床资料、骨髓和外周血涂片、骨髓活检进行分析，按照WHO 造血和淋巴组织肿瘤分类标准（2008）进行诊断。

1.3 方法

CALR 基因突变分析：用血液基因组DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，生产商：Qiagen 公司）提取骨髓细胞基因组DNA，CALR9 号外显子PCR 扩增引物（生产商：Invitrogen 公司；使用浓度：5.0 pmol/μL；贮存条件：干粉于-20℃保存，工作液于4℃保存；有效期：-20℃为1 年，4℃为半年），设计序列：引物名称：CALR-X9-Fwd， 引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT； 引物名称：CALR-X9-Rev， 引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。 PCR 体 系 包 括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN 公司产品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水离子补足体系至30 μL。 反应条件：98°C 预变性3 min，98°C变性10 s，63°C 退火30 s，72°C 延伸30 s，共29 个循环，72°C 延伸5 min。PCR 扩增产物经回收、纯化后实验数据采用片段分析软件Genemapperid V4.1 进行分析，分析示例见图1。

图1 Genemapperid V4.1 软加分析示例

2 结果

2.1 72 例MPN 患者临床及实验室检查特点

根据2008 年WHO 分型诊断标准，PV 22 例、ET 26 例、PMF 23 例、MPN-u 1 例。所有患者均接受常规治疗至随访结束，患者均存活。在8 例CALR 突变的ET患者血小板计数高于JAK2 突变阳性患者（表1）；8例CALR 突变的PMF 患者中7 例为男性，发病年龄较小，且呈现出较低的白细胞计数、血红蛋白水平（表2）。

表1 8 例CALR 突变ET 患者初诊时临床、实验室特征

表2 8 例CALR 突变PMF 患者初诊时临床、实验室特征

2.2 JAK2V617F、CALR 及MPL515 基因突变检测结果

22 例PV 患者中16 例携带有JAK2V617F 突变（突变率为68%），未检测出CALR 基因突变；26 例ET患者中12 例携带有JAK2V617F 突变（突变率为46%），8 例检测出CALR 基因突变（突变率为31%），JAK2V617F突变阴性患者中CALR 基因突变率为57%（8/14）；23例PMF 患者中11 例携带有JAK2V617F 突变（突变率为49%），8 例检测出CALR 基因突变（突变率为35%），JAK2V617 突变阴性患者中CALR 基因突变为为67%（8/12）。 在72 例患者中均未检测到MPL515 突变。

3 讨论

CALR 为Ca2+结合蛋白复合体， 主要定位于内质网（edoplasmic reticulum，ER）腔内。CALR 基因定位于染色体19p13.2～p13.3，包含9 个外显子，大小为4.2 kb，其编码的CALR 由高度保守近似球形结构的N 端（1～180 氨基酸残基）、 参与ER 内Ca2+储存的酸性c端（291～400 氨基酸残基）及中间富含脯氨酸而形成的具伸出式结构的P 端（181～290 氨基酸残基）。 3 个结构域均具有各自特殊的功能，N 端及P 端主要发挥分子伴侣的作用，C 端的作用主要为调节ER 中的Ca2+浓度， 保持细胞内Ca2+稳态，CALR 基因缺失将减少ER 内Ca2+的储存量。CALR C 端的终点为ER 滞留信号（KDEI） 肽，KDEL 可使CALR 从高尔基体回到ER，阻止其分泌至ER 外，具有靶向定位作用。多项研究发现CALR 突变呈阳性MPN 患者骨髓细胞中突变型CALR 大部分定位于ER 内[6]。 同时，CALR 介导的Ca2+稳态的调节可影响多种细胞功能， 包括巨核细胞分化成熟及血小板的形成、 整合素介导的信号转导、免疫应答、细胞凋亡、增殖及吞噬作用、介导伤口愈合及纤维化。 早期研究证实BCR/ABL1 阴性MPN 患者存在JAK2V617 突变。Kampfl 等[6]和Nangalia 等[7]采用外显子测序的方法在JAK2/MPL 阴性的大部分标本中检测到CALR 第9 个外显子突变。并对大样本健康人群进行CALR 目标基因检测，结果发现在健康个体对照组、淋巴系肿瘤、急性白血病及实体肿瘤中均未见CALR 基因突变。 结果提示CALR 基因突变为JAK2 及MPL 基因突变阴性的ET 及PMF 的特异性分子标志物。 因CALR 基因突变均位于第9 个外显子， 本研究采用直接检测第9 个外显子的方法在JAK2 基因突变阴性的ET 患者中检测到CALR 突变率为57%；23 例PMF 患者中8 例检测出CALR 基因突变（突变率35%）；研究表明，CALR 基因突变不会发生在PV 患者中， 本组22 例患者中均未检测到CALR 基因突变也证实了这一观点。 2014 年，Tefferi等[8]检测了576 例ET 患者中，CALR 的突变率为15%；Rumi 等[9]检测了745 例患者，CALR 的突变率为24%；Chi 等[10]检测了289 例患者，CALR 的突变率为9%；Kim 等[11]检测CALR 突变率为12.6%。 本实验中ET 患者CALR 的突变率为31%，在JAK2/MPL 阴性的ET患者中突变率57%，而国内学者报道436 例亚洲人CALR基因突变情况，CALR 基因的突变率为22.7%，在JAK2/MPL 阴性的ET 患者中， 其突变率为52.7%，本实验与国内报道相符。 Rumi 等[12]对CALR 突变呈阳性ET 患者研究发现， 极少数患者的CALR 突变的等位基因负荷＞75%，该结果推测ET 的发生可能为杂合子克隆逐步积累，最终在骨髓中占据数量优势，特异性刺激巨核细胞导致。本研究显示CALR 突变患者均为杂合子。 本研究中PMF 患者CALR 基因突变（突变率35%），与Langabeer 等[13]报道的25%～35%的突变率相似。研究发现CALR 突变与其临床表现和预后有重要的相关性。 在ET 和PMF 患者中，CALR 基因突变PMF 患者较JAK2 突变者血小板计数更高、年龄更小、血红蛋白更低，白细胞计数更低，PMF 患者具有更好的生存率[14]，本研究中患者也具有以上临床特点。有文献报道发生CALR 和JAK2 突变者发生心血管事件的概率是13.4%和30.1%，10 年血栓症累计发生率分别为5.1%和14.5%。 在PMF 患者中，Tefferi 等[8]在254 例标本中筛查了一些与MPN 相关的基因突变，发现他们与CALR 突变没有显著的分子或遗传学关联。 Tefferi 等[15]也报道在PMF 患者中，发生1 型CALR 突变者比2 型突变者有更好的预后。 由本组实验可以看出，CALR 是MPN 中较易发生突变的基因，可将CALR 突变检测纳入MPN 诊断的常规指标。 在临床上可以遵循以下思路考虑对MPN 的诊断[16-20]：①由于CALR 突变不发生在PV 的患者，所以它不能用来筛查PV 或PV 后骨髓纤维化的疑似患者；②CALR、JAK2 和MPL 突变是互相排斥的， 对已知发生了JAK2 或MPL 突变的患者无需筛查CALR 突变；③由于MPL 突变率在三者中最低， 对ET 或PMF 的疑似病例，应先行JAK2V617 突变筛查，若阴性再行CALR突变筛查，CALR 阴性则行MPL 突变筛查。 尽管CALR 基因突变等为疾病的诊断提供了较为特异的分子指标，但仍有10%的ET 和PMF 患者需要结合骨髓病理检查结果加以诊断。

综上所述，CALR 基因突变是JAK2V617F 突变阴性的MPN 特异性分子标志物。 将CALR 基因突变检测纳入MPN 诊断标准可以提高诊断的准确性减少漏诊率。 CALR 基因突变的检测有助于JAK2V617F 突变阴性的MPN 的鉴别诊断， 对CALR 基因突变功能的进一步研究可望找到JAK2V617 突变阴性MPN 的分子治疗靶标。

[1] Campbell PJ，Green AR.The myeloproliferative disorders[J].N Eng J Med，2006，355（24）：2452-2466.

[2] Levine RL，Gilliland DC. Myeloproliferative disorders [J].Blood，2008，112（6）：2190-2198

[3] 刘樱子.CALR 基因突变在骨髓增殖性肿瘤中的进展[J].国际输血及血液学杂志，2014，37（6）：556-560

[4] Pikman Y，Lee BH，Mercher T， et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia [J]. PLoS Med，2006，3（7）：e270.

[5] 王婕妤，艾晓菲，徐俊卿，等.Ph 染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者JAK2 基因第12 外显子突变研究[J].中华血液学杂志，2012，33（9）：705-709.

[6] Klampfl T，Gisslinger H，Harutyunyan AS，et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms[J].Engl J Med，2013，369（25）：2379-2390.

[7] Nangalia J，Massie CE，Baxter EJ，et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2 [J]. N Engl J Med，2013，369（25）：2391-2405.

[8] Tefferi A，Lasho TL，et al.CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis：clinical，cytogenetic and molecular comparisons [J]. Leukemia，2014，28（7）：1472-1477.

[9] Rumi E，Pietra D，ferretti V，et al. JAK2 orCALR mutation status defines of essential thromboeythemia with substantially Different clinical course and outcomes[J].Blood，2014，123（10）：1544-1551.

[10] Chi J，Nicolaidou V，Nicolaidou V，et al. Calreticulin exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis [J].Leukemia，2013，28（5）：1152-1154.

[11] KimSY，ImK，ParkSN，etal.CALR，JAK2，and MPL mutation profiles in patients with four different subtypes of myeloproliferative neoplasms：primary myelofibrosis，essential thrombocythemia，polycythemiavera，andmyeloproliferative neoplasm，unclassifiable [J]. Am J Clin Pathol. 2015，143（5）：635-644.

[12] Rumi E，Pietra D，Ferretti V，et al.JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes [J].Blood，2014，123（10）：1544-1551.

[13] Langabe er SE，Andrikovics H， Asp J，et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms [J]. Eur J Haematol EUR，2015.doi：10.1111/ejh.12578. [Epub ahead of print]

[14] Jones AV，Ward D，Lyon M，et al. Evaluation of methods to detect CALRmutationsinmyeloproliferativeneoplasms[J].Leuk Res，2015，39（5）：530-535.

[15] Tefferi A，Lasho TL，Finke C，et al.Type 1 vs 2 calretieulin mutations in primary myelofibrosis：differences in phenotype and prognostic impact [J]. Leukemia，2014，28（7）：1568-1570.

[16] 谭栩，杨泽松，彭曦，等.原发性骨髓纤维化的治疗进展[J].疑难病杂志，2014，13（5）：542-545.

[17] 邢莉民，邵宗鸿.BCR/ABL 阴性骨髓增殖性肿瘤血管新生的研究现状[J].中华医学杂志，2015，95（18）：1432-1434.

[18] 张群峰，刘维薇，关明，等.骨髓增殖性肿瘤的新分子标志物钙网蛋白基因突变[J].中华检验医学杂志，2014，（9）：649-652.

[19] 欧阳苑，乔纯，王菊娟，等.BCR-ABL 阴性MPN 患者CALR、JAK2 及MPL 基因突变分析[J].中华医学杂志，2015，95（18）：1369-1373.

[20] Tefferi A，Pardanani A. CALR mutations and a new diagnostic algorithm for MPN [J]. Nat Rev Clin Oncol，2014，11（3）：125-126.