γ-干扰素释放试验体液(浆膜腔积液和脑脊液)检测诊断结核病的临床应用

刘晓清



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γ-干扰素释放试验体液(浆膜腔积液和脑脊液)检测诊断结核病的临床应用

刘晓清

结核病仍为全球重大公共卫生问题，中国结核病负担高，肺外结核较其他国家所占比例大。而肺外结核常见形式——结核性浆膜腔炎的诊断金标准(病原学或病理)有敏感度差等不足，因此找到一种新的敏感度高、较快速的结核性浆膜腔积液的诊断方法十分必要，以提高结核病的早期诊断水平，对结核病的防控具有重要意义。

结核, 胸膜/诊断； 腹膜炎, 结核性/诊断； 心包炎, 结核性/诊断； 干扰素γ释放试验

目前结核病仍属重大全球公共卫生问题，中国在全球22个结核病高负担国家中居第二位[1]。在中国，肺外结核占所有活动性结核病的9.2%～11.2%[2]，而在儿童中，这个比率为23.5%[3]。

肺外结核的常见形式为结核性浆膜腔积液，包括结核性胸膜炎、腹膜炎及心包炎，而且也是浆膜腔积液的常见病因，尤其是在结核病高流行地区[4-6]。浆膜腔积液培养或组织活检病理学检查被认为是结核性浆膜腔类诊断的金标准，但是，上述两种方法存在所需时间长、敏感度差、具有有创性等缺点。根据我国台湾的一项研究，胸腔积液培养敏感度仅为63%，尽管这已经高于之前的报道；而对于胸膜活检，报道的敏感度相似，为74%[7]。

γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assays, IGRAs)通过检测由Mtb基因组差异区1(region of difference, RD1)基因编码的Mtb特异性抗原刺激效应T淋巴细胞而分泌的γ-干扰素(IFN-γ)以判断有无结核感染。目前，已成为敏感度及特异度均较高、无创且较快速的结核病辅助诊断手段。近年来国内有IGRAs辅助诊断结核性胸膜炎和结核性腹膜炎等肺外结核的报道，其中胸腔积液和腹腔积液等体液采用IGRAs检测的敏感度和特异度高达90%以上[8]。笔者就IGRA体液(浆膜腔积液和脑脊液)检测诊断结核病的临床应用进行阐述和讨论。

IGRAs检测结核感染的原理

一、基本原理[8]

受到Mtb抗原刺激致敏的T淋巴细胞再次遇到同类抗原时可产生IFN-γ，IGRAs通过检测全血或分离自全血的单个核细胞在Mtb特异性抗原刺激下产生的IFN-γ，判断受试者是否为结核感染。人体感染Mtb后初始T淋巴细胞主要分化为Mtb抗原特异性的效应T细胞和记忆T细胞，后者又分为中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞,当再次接受Mtb抗原多肽时发生快速增殖，并分泌细胞因子，其中包含大量的IFN-γ。IGRAs的实质是检测Mtb抗原特异性T淋巴细胞在体外对Mtb特异性抗原刺激后的反应，与检测标本中Mtb抗原特异性T淋巴细胞的数量和反应能力存在相关性。

二、临床应用原理

许多研究认为在活动性结核病患者中，Mtb特异性的IFN-γ释放高于潜伏结核感染(LTBI)患者，可能是由于Mtb菌量不同导致反应强度不同。但是在活动性结核感染患者中也有较LTBI反应弱的患者，可能是由于免疫失能所致[1]。结核病灶局部特异性效应淋巴细胞的分布密度要高于外周血，但在渗出液中是否如此，尚需有细胞计数的对比分析。抗原特异性T淋巴细胞在胸膜腔中区域化在之前的研究中曾有报道[9]，而且在小鼠模型中也发现了T淋巴细胞在胸膜腔中的聚集，Mtb特异性的T淋巴细胞聚集是选择素介导的迁徙及局部增殖的结果[10]。在结核性胸膜炎患者中，胸腔积液中的许多细胞因子如IFN-γ较外周血中高。所以，在感染部位对Mtb特异性分泌IFN-γ的T淋巴细胞浓度进行测定，使结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测浆膜腔积液较检测外周血对于诊断结核性浆膜腔积液价值更高[1]。目前，国际上IGRAs技术有3种：(1)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测全血中致敏T细胞再次受到Mtb特异性抗原刺激后释放的IFN-γ水平，称之为全血检测或结核感染T细胞免疫检测；(2)采用酶联免疫斑点技术(ellzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)测定在Mtb特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放IFN-γ的效应T细胞数量，称之为细胞检测或结核感染T细胞检测；(3) 检测在Mtb特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞培养液中IFN-γ的量。上述3种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，均采用Mtb的RDl区基因编码抗原多肽作为特异性抗原，主要有相对分子质量为6000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相对分子质量为10 000的培养滤液蛋白(CFP-10)抗原或抗原多肽。有些产品在此基础上增加了TB7.7抗原多肽。后两种方法均可去除全血方法的一些干扰因素，如在免疫抑制的患者中，去除免疫活性的T细胞数量存在的个体差异，但对技术和实验条件也要求较高。

IGRAs临床应用现状

目前，IGRAs检测的适应证主要包括LTBI的诊断和活动性结核病的辅助诊断。现有关于IGRAs应用的绝大部分指南来自结核病低负担的发达国家，欧美等发达国家通常推荐将IGRAs用于辅助诊断Mtb感染[8]。

近几年来，国内有IGRAs(仅限于ELISPOT方法)辅助诊断结核性胸膜炎和结核性腹膜炎等肺外结核的报道[11-12]，其中采用胸腔积液和腹腔积液等体液检测的IGRAs的敏感度和特异度高达90%以上。此类研究报道数量不多，病例数也不足，且目前我国国家食品药品监督管理总局(SFDA)批准的IGRAs仅限于血液样本的检测，即IGRAs对体液或组织标本的研究尚需进一步扩大样本验证[8]。

一、IGRAs(ELISPOT方法)浆膜腔积液和脑脊液检测技术流程[12]

1.制备浆膜腔积液单个核细胞：(1)100 ml无菌生理盐水瓶采集患者胸腔积液或腹腔积液或心包积液约50 ml，每100 ml加2500 IU(0.4 ml)肝素抗凝； (2)取抗凝后胸腔积液或腹腔积液或心包积液标本40 ml，相对离心力800×g，离心5 min后弃去上清，将管底细胞悬起；(3)10 ml生理盐水洗涤，相对离心力800×g，离心5 min后弃去上清；(4)用4 ml生理盐水将收集到的胸腔积液或腹腔积液或心包积液中单个核细胞制成细胞悬液；(5)取人淋巴细胞分离液4 ml入15 ml灭菌离心管内；(6)用5 ml加样器充分混匀“步骤4”制成的细胞悬液，在距分层液1 cm处沿试管壁徐徐加入，使细胞悬液重叠于分层液上；(7)相对离心力900×g，无刹车离心20 min；(8)吸出单个核细胞层，移入另一15 ml离心管中；(9)10 ml生理盐水洗涤，相对离心力800×g，离心5 min后弃去上清；(10)用10 ml AIM-V细胞培养基使细胞重悬混匀，取25 μl细胞悬液至75 μl 0.4%台盼蓝中，混匀，取样加入血细胞计数板，显微镜下计数；(11)相对离心力500×g，离心7 min后弃去上清，用AIM-V培养基将细胞悬液浓度调整至2.5×106/ml。

2.制备脑脊液单个核细胞：(1)无菌小瓶采集患者脑脊液，每4 ml加入100 IU(约0.02 ml)肝素抗凝；(2)在15 ml高压灭菌离心管中用生理盐水将标本稀释至10 ml；(3)相对离心力500×g，离心7 min后弃去上清，将管底细胞悬起；(4)10 ml生理盐水洗涤，相对离心力500×g，离心7 min后弃去上清；(5)用10 ml AIM-V培养基使细胞重悬混匀，取25 μl细胞悬液至75 μl 0.4%台盼蓝中，混匀，取样加入血细胞计数板，显微镜下计数；(6)相对离心力500×g，离心7 min后弃去上清，用AIM-V培养基将细胞悬液浓度调整至2.5×106/ml。

3. T-SPOT.TB检测：(1)在已包被抗IFN-γ单抗的96孔板上，分别单孔加入50 μl细胞培养基作为空白对照，50 μl植物血凝素作为阳性对照，分别以50 μl Mtb特异性ESAT-6和CFP-10肽段库(终浓度10 μg/ml)作为刺激原(英国牛津免疫技术公司出品)；(2)每孔中加入100 μl浆膜腔积液单个核细胞悬液(浓度为2.5×106/ml)；(3)将96孔板置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育 16～18 h；(4)按200 μl/孔加入1×PBS(磷酸盐缓冲液)，静置30 s后甩去，重复4次；(5)用1×PBS按1∶200比例稀释碱性磷酸酶标记的二抗，50 μl/孔加入稀释液，保鲜膜包好，置4 ℃冰箱1 h；(6)重复“步骤4”；(7)每孔加入显色底物液5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐-四氮唑蓝(BCIP-NBT)，室温避光静置7 min；(8)去离子水终止反应，洁净台风口处吹干；(9)观察结果，并用ELISPOT 计数仪(AID iSPOT Reader Spectrum，德国)进行斑点阅读与统计。

二、浆膜腔积液及脑脊液IGRAs检测对于结核性浆膜炎及结核性脑膜炎的诊断价值

根据近年来报道，T-SPOT.TB检测浆膜腔积液较检测外周血敏感度及特异度均较高。一项多中心的研究数据显示与外周血T-SPOT.TB检测相比，胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度由76%提高至95%，特异度由67%提高至95%[13]。

根据一项北京协和医院187例患者的队列研究报道，浆膜腔积液T-SPOT.TB检测较外周血的敏感度 (91.9%及73.0%,P=0.002)、特异度(87.1%及73.1%,P=0.017)、阳性预测值(85.0%及68.4%,P=0.013)及阴性预测值 (93.1%及77.3%,P=0.003)均高。胸腔积液、腹腔积液及心包积液的T-SPOT.TB 检测敏感度分别为88.9%, 94.4% 及100.0%[1]。

SFDA推荐了24个斑点形成细胞(SFCs)/106PBMC(即6个SFCs/2.5×105PBMCs)作为外周血T-SPOT.TB的临界值(cutoff值)诊断活动性及潜伏结核感染。对于结核性浆膜腔积液的诊断，上述研究[1]显示浆膜腔积液的T-SPOT.TB检测以56个SFCs/106SEMC(浆膜腔积液单个核细胞)，即14个SFCs/2.5×105SEMC作为cutoff值,受试者操作特性曲线(ROC)下面积最大，其敏感度及特异度分别为90.5% 和89.2%。

一项来自韩国结核性腹膜炎患者的研究显示，腹腔积液ELISPOT (24个SFCs/106SEMC，即6个SFCs/2.5×105SEMC作为cutoff值)检测的敏感度及特异度分别为87%和86%[14]。

一项中国深圳结核性胸膜炎患者的研究显示，胸腔积液ELISPOT 检测的敏感度及特异度分别为95.7%及100.0%，均高于外周血(78.3%及86.3%)[15]。

一项中国北京胸科医院结核性胸膜炎患者的研究显示,胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度与外周血相近 (96.3%及92.7%) (P=0.691)；而胸腔积液T-SPOT.TB检测的特异度(94.5%) 远高于外周血(76.1%) (P=0.002)。cutoff值为216个SFCs/106PFMCs(胸腔积液单个核细胞)[16]。

在非亚洲国家中，一项来自南非的对结核性胸膜炎患者的研究显示，胸腔积液γ-干扰素浓度cutoff值定为0.83 IU/ml，敏感度为 87%，特异度为71%[17]。一项土耳其结核性胸膜炎患者的研究显示，使用改良的QuantiFERON®-TB Gold In-Tube test(QFT-GIT)试剂盒(以ESAT-6、CFP-10和TB7.7合成多肽为刺激抗原，TB7.7位于RD13)诊断结核性胸膜炎，其敏感度及特异度分别为48.8% 及79.3%[18]。

韩国Kim等[19]一项包括37例疑诊结核性脑膜炎患者脑脊液和外周血T-SPOT.TB检测的研究，12例患者诊断为结核性脑膜炎，25例患者除外了活动性结核病，脑脊液ELISPOT检测的敏感度及特异度分别为75% (95%CI：19%～99%)和75% (95%CI： 43%～95%)。该研究结果显示，中枢神经系统Mtb感染患者脑脊液与外周血T-SPOT.TB检测的SFCs数比值中位数ESAT-6抗原为5.2，CFP-10抗原为2.9。当以脑脊液与外周血的SFCs比值大于或等于2为cutoff时，检测敏感度为50%(95%CI：7%～93%)，特异度为100%(95%CI：74%～100%)。

一项来自印度的结核性脑膜炎患者的IGRAs研究，包括11例患者诊断为结核性脑膜炎，9例患者除外了结核性脑膜炎。结果显示，脑脊液ELISPOT检测的敏感度为90% (95%CI：56%～100%)，特异度为100% (95%CI：59%～100%)，脑脊液与外周血检测的SFCs数差异无统计学意义[20]。

但以上研究的患者例数均不多，且不同试剂的研究存在人群入组标准、所用IGRAs检测试剂和判断标准等不一致的问题，目前还难以获得浆膜腔积液和脑脊液IGRAs在临床应用的充分循证数据。

三、几点建议

归纳不同指南的观点，主要有以下相对一致或相近的建议[8]：(1)IGRAs不能有效区分活动性结核病和LTBI，因此IGRAs对活动性结核病的诊断价值有限，尤其在结核病高负担国家；(2)无论是特异度还是敏感度，IGRAs均优于或至少不差于PPD试验，因此在诊断LTBI方面，发达国家多推荐单独或联合应用IGRAs。

PPD试验和IGRAs均无法区分LTBI和活动性结核病患者。国内IGRAs的研究数据显示其敏感度和特异度差别较大，敏感度为53%～98%，特异度为60%～90%(或以上)，但多数文献报道的敏感度和特异度>70%，提示IGRAs的特异度优于PPD试验[8]。考虑到我国肺结核患者中菌阴肺结核所占比例较高，在诊断这类患者缺乏细菌学依据时，IGRAs可发挥其辅助作用。故建议：(1)IGRAs不能用于确诊或排除活动性结核病，但对缺少细菌学诊断依据的活动性结核病(如菌阴肺结核等)，IGRAs可在常规诊断依据的基础上，起到补充或辅助诊断的作用；(2)IGRAs检测胸腔积液和腹腔积液等非血液标本的检测程序、判断标准和诊断效能有待进一步研究[8]。

小 结

中国为结核病高负担国家，且肺外结核占有一定比例，鉴于肺外结核病原学及病理诊断阳性率均较低，找到一种较好的诊断方法尤为重要。肺外结核以浆膜炎为常见，目前研究均显示浆膜腔积液IGRAs检测的敏感度与特异度较外周血高，但报道数量不多，各个报道的患者例数也不足，因此对非血液的体液标本进行IGRAs的研究尚需进一步经过大样本研究进行验证，从而得出更可靠的循证医学依据。IGRAs检测胸腔积液和腹腔积液等非血液标本的检测程序、判断标准和诊断效能均有待进一步研究。

[1] Zhang L, Zhang Y, Shi X, et al. Utility of T-cell interferon-c release assays for diagnosing tuberculous serositis: a prospective study in Beijing, China. PLoS One, 2014, 9(1): e85030.

[2] 黄建生，沈梅，孙亚玲. 上海市肺外结核的流行病学分析. 中华结核和呼吸杂志, 2000, 23(10): 606-608.

[3] Wu XR, Yin QQ, Jiao AX, et al. Pediatric tuberculosis at Beijing Children’s Hospital: 2002—2010. Pediatrics, 2012, 130(6): e1433-1440.

[4] Peto HM, Pratt RH, Harrington TA, et al. Epidemiology of extrapulmonary tuberculosis in the United States, 1993—2006. Clin Infect Dis, 2009, 49(9): 1350-1357.

[5] Sharma SK, Mohan A. Extrapulmonary tuberculosis(Review). Indian J Med Res, 2004, 120(4): 316-353.

[6] Valdés L, Alvarez D, Valle JM, et al. The etiology of pleural effusions in an area with high incidence of tuberculosis. Chest, 1996, 109(1): 158-162.

[7] Ruan SY, Chuang YC, Wang JY, et al. Revisiting tuberculous pleurisy: pleural fluid characteristics and diagnostic yield of mycobacterial culture in an endemic area. Thorax, 2012, 67(9): 822-827.

[8] 中华医学会结核病学分会，《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会.γ-干扰素释放试验在中国应用的建议. 中华结核和呼吸杂志, 2014，37(10): 744-747.

[9] Barnes PF, Lu S, Abrams JS, et al. Cytokine production at the site of disease in human tuberculosis. Infect Immun, 1993, 61(8): 3482-3489.

[10] Souza MC, Penido C, Costa MF, et al. Mechanisms of T-lymphocyte accumulation during experimental pleural infection induced byMycobacteriumbovisBCG. Infect Immun, 2008, 76(12): 5686-5693.

[11] 王永生，徐小雅，杨华，等．T-SPOT.TB试剂盒在结核性胸膜炎临床诊断中的应用价值．四川医学，2011，32(12)：1854-1856．

[12] 张丽帆，刘晓清. 胸腹水、脑脊液中结核分枝杆菌RD1基因编码抗原刺激后释放γ-干扰素的特异性T细胞检测. 中国医学科学院报, 2009,31(4):438-442.

[13] Losi M, Bossink A, Codecasa L, et al. Use of a T-cell interferon-gamma release assay for the diagnosis of tuberculous pleurisy. Eur Respir J, 2007, 30(6): 1173-1179.

[14] Lee JY, Kim SM, Park SJ, et al. A rapid and non-invasive 2-step algorithm for diagnosing tuberculous peritonitis using a T cell-based assay on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells together with peritoneal fluid adenosine dea-minase. J Infect, 2015,70(4): 356-366.

[15] Liao M, Yang Q, Zhang J, et al. Gamma interferon immunospot assay of pleural effusion mononuclear cells for diagnosis of tuberculous pleurisy. Clin Vaccine Immunol， 2014, 21(3):347-353.

[16] Liu F, Gao M, Zhang X, et al. Interferon-gamma release assay performance of pleural fluid and peripheral blood in pleural tuberculosis. PLoS One, 2013, 8(12): e83857.

[17] Chegou NN, Walzl G, Bolliger CT, et al. Evaluation of adapted whole-blood interferon-gamma release assays for the diagnosis of pleural tuberculosis. Respiration, 2008, 76(2):131-138.

[18] Ates G, Yildiz T, Ortakoylu MG, et al. Adapted T cell interferon-gamma release assay for the diagnosis of pleural tuberculosis. Respiration, 2011, 82(4):351-357.

[19] Kim SH, Chu K, Choi SJ, et al. Diagnosis of central nervous system tuberculosis by T-cell-based assays on peripheral blood and cerebrospinal fluid mononuclear cells. Clin Vaccine Immunol, 2008, 15(9):1356-1362.

[20] Thomas MM, Hinks TS, Raghuraman S, et al. Rapid diagnosis ofMycobacteriumtuberculosismeningitis by enumeration of cerebrospinal fluid antigen-specific T-cells. Int J Tuberc Lung Dis, 2008, 12(6):651-657.

(本文编辑：薛爱华)

The clinical application of IGRA test in body fluid (serositis and cerebral spinal fluid) for diagnosis of tuberculosis

LIU Xiao-qing.

Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730, China

LIU Xiao-qing，Email：liuxqpumch@126.com

Tuberculosis remains the great global health problem, and the disease burden is high in China. The proportion of extrapulmonary tuberculosis is more than other countries. Tuberculosis serositis is the most common form of extrapulmonary tuberculosis, but the golden diagnosis criterion of tuberculosis serositis has some shortcomings such as a low sensitivity and so on. Therefore, to discover a rapid diagnostic method of high sensitivity is necessary to diagnose tuberculosis in early stage, which is vital for control and prevention of tuberculosis.

Tuberculosis, pleural/diagnosis； Peritonitis, tuberculous/diagnosis； Pericarditis, tuberculous/diagnosis； Interferon-gamma release tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.003

100730 中国医学科学院 北京协和医院感染科

刘晓清，Email：liuxqpumch@126.com

2015-02-28)