酶法制备大豆肽的研究

■修立颖 单春乔 李晶晶 刘秋晨 江国托

（大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连 116036）

大豆肽是以豆粕、大豆或大豆分离蛋白为底物经化学水解、微生物发酵法或酶解法水解作用，再分离、精制等工艺制得的混合低聚肽。通常由3～6个氨基酸组成的低分子肽，蛋白质含量为85%左右，氨基酸组成与大豆蛋白质大体相同，必需氨基酸含量丰富且平衡[1]。大豆肽的平均分子量小于 1 000 Da，主要出峰位置在分子量为300～700 Da[2]。大豆肽具有良好的生物活性，如具有易吸收和低过敏原性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢等特性，被广泛应用在醋、酱油、奶酪、发酵食品中，可以提高产品品质和营养价值，并增强产品的口感风味等。近年来，酶解法以产品安全性高、生产条件温和、水解易控制，而且对氨基酸的破坏较小[3]等优点被广泛应用。一般选择植物蛋白酶、动物蛋白酶或微生物蛋白酶进行单酶、双酶，多酶酶解大豆蛋白[4]，而微生物蛋白酶具有成本低、水解效率高、来源广泛得到大范围的使用。本研究采用微生物蛋白酶进行合理配比对豆粕进行水解，以筛选到最佳的复合酶制剂配比，既提高水解率又可以解决苦味值问题。复合酶的水解豆粕，工艺简单具有实际生产意义[5-7]。但是，酶解液中的苦味一直困扰整个行业，我们通过研究复合酶的配比来解决这一难题。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

食用豆粕，购自赣榆县连香花生油厂；盐酸（AR），购自丹东龙海试剂厂；氢氧化钠（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；硫酸（AR），购自丹东龙海试剂厂；硫酸铜（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；硫酸钾（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；硼酸（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；甲基红（AR），购自沈阳市试剂三厂；溴甲酚绿（指示剂），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；三氯乙酸（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；盐酸奎宁（AR），购自天津市科密欧化学试剂开发中心；乙醇（95%），购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 试验仪器和设备

LD天平，购自沈阳龙腾电子有限公司；THZ-25大容量恒温振动器，购自太仓市华美生化仪器厂；pHS-3C精密pH计，购自上海虹益仪器仪表有限公司；大容量离心机，购自湘仪离心机仪器有限公司；电热恒温水浴锅，购自北京市长风仪器仪表厂；K9840型自动凯氏定氮仪，购自济南海能仪器有限公司；消化炉，购自济南海能仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质含量的测定

按GB5009.5—2010中凯氏定氮法进行测定。

1.3.2 水解率测定

1.3.3 酸溶蛋白含量的测定

量取10 ml酶解液，加入10 ml 15%三氯乙酸（TCA）溶液混匀后静置10 min，在4 000 r/min离心20 min。取上清液测定其蛋白质含量，即为酸溶蛋白含量。

1.3.4 苦味评价方法

称取盐酸奎宁0.1 g溶于100 ml 95%乙醇溶液中，取10 ml用水稀释至100 ml，配成1.0×10-4g/ml的盐酸奎宁溶液，进一步稀释到9.0×10-5、8.0×10-5、7.0×10-5、6.0×10-5、5.0×10-5、4.0×10-5、3.0×10-5、2.0×10-5、1.0×10-5，其苦味值分别定为10～1。将大豆分离蛋白的水解液与不同浓度的盐酸奎宁比较，确定苦味值[8]。

1.4 制备方法

大豆分离蛋白的提取方法：称取10 g豆粕粉→按照提取固液比混合→一定温度下搅拌→调节pH值→提取一定时间→离心（5 500 r/min、10 min）→取上清液→测定蛋白质含量（凯氏定氮法）→计算水解率。

2 大豆分离蛋白提取分离优化条件

2.1 单酶法制备大豆肽

根据购自的酶制剂厂家提供使用单酶的最佳酶解条件，对不同厂家的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶进行单酶的水解，以水解率、苦味值、酶活力为指标选择最适厂家的单酶。得到购自A公司的中性蛋白酶的最佳酶解条件是pH值8.0、温度45℃、加酶量7 500 U/g、时间4.5 h。根据最佳酶解条件，进行验证试验，水解率可达81.26%，苦味值为7；购自B公司的碱性蛋白酶的最佳酶解条件：pH值10.0，加酶量10 000 U/g、温度55℃、时间4.5 h，水解率达91.24%，苦味值为9；购自C公司的胰蛋白酶最佳酶解条件：pH值8.0、加酶量7 500 U/g、温度50 ℃、时间4.5 h，水解率达79.04%，苦味值为8。

2.2 复合酶法制备大豆肽

2.2.1 碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解

在碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶解大豆分离蛋白的单酶酶解试验的基础上，加酶总量取5 000 U/g[9]，同步酶解。对影响复合酶酶解的pH值、加酶比、温度、时间进行L9（34）正交试验，试验的条件和结果见表1、表2。

表1 正交试验因素水平设计

表2 正交试验结果

由表2可以看出，对碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白条件的影响因素的主次顺序为：D(时间)＞A（加酶比）＞B（pH值）＞C（温度），最佳的酶解条件为A1B3C2D3，即碱性蛋白酶∶中性蛋白酶加酶比1∶1、pH值9.5、温度50℃、时间4.5 h。根据最佳酶解条件，进行验证试验，水解率可达86.25%，但是碱性蛋白酶与中性蛋白酶的水解液的苦味值都很高，苦味值为5。

2.2.2 中性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解

在中性蛋白酶与胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白的单酶酶解试验的基础上，加酶总量取5 000 U/g，对影响复合酶酶解的pH值、加酶比、温度、时间进行L9（34）正交试验，试验的条件和结果见表3、表4。

表3 正交试验因素水平设计

表4 正交试验结果

由表4可以看出，对中性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白条件的影响因素的主次顺序为：C（温度）＞D(时间)＞B（pH值）＞A（加酶比），最佳的酶解条件为A1B3C3D3，即中性蛋白酶∶胰蛋白酶加酶比1∶1、pH值8.5、温度50℃、时间4.5 h，根据最佳酶解条件，水解率可达85.17%，苦味值为4。

2.2.3 碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解

在碱性蛋白酶与胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白的单酶酶解试验的基础上，加酶总量取5 000 U/g，对影响复合酶酶解的pH值、加酶比、温度、时间进行L9（34）正交试验，试验的条件和结果见表5、表6。

由表6可以看出，对碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白条件的影响因素的主次顺序为：D(时间)＞C（温度）＞A（加酶比）＞B（pH值），最佳的酶解条件为A1B1C1D3，即碱性蛋白酶∶胰蛋白酶加酶比1∶1、pH值8.5、温度45℃、时间4.5 h。根据最佳酶解条件，进行验证试验，水解率可达83.33%，苦味值也较高，为5。

表5 正交试验因素水平设计

表6 正交试验结果

2.3 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶复合酶解

在碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白的单酶酶解试验的基础上，加酶总量取5 000 U/g，对影响复合酶酶解的pH值、加酶比、温度、时间进行L9（34）正交试验，试验的条件和结果见表7、表8。

表7 正交试验因素水平设计

表8 正交试验结果

由表8可以看出，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白条件的影响因素的主次顺序为：A（加酶比）＞D(时间)＞C（温度）＞B（pH值），最佳的酶解条件为A2B2C2D3，即碱性蛋白酶∶中性蛋白酶∶胰蛋白酶加酶比1∶2∶3、pH值8.5、温度50℃、时间4.5 h。根据最佳酶解条件，进行验证试验，水解率可达86.39%，而苦味值仅仅为2。

2.4 单酶复合酶酶解效果比较（见表9）

表9 单酶、复合酶酶解效果对比

对比单酶与复合酶酶解的水解率及苦味值两方面因素，三酶复合比较适合用于制备水解率高、苦味低的大豆低聚肽。

3 结论

本文通过研究大豆肽的生产工艺，以豆粕为发酵原料，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶微生物发酵产物酶解豆粕的工艺条件摸索，最终确定最佳复合酶的配比及酶解的条件，即碱性蛋白酶∶中性蛋白酶∶胰蛋白酶比为1∶2∶3，酶解条件是pH值8.5，温度50℃，时间为4.5 h，水解率为86.39%，苦味值为2。

综合以上试验结果和数据可知，对比单酶与复合酶酶解的水解率及苦味值两方面因素，三酶复合比较适合用于制备高收率、低苦味的大豆低聚肽。