复合酶与酵母联合发酵甘草渣饲料化工艺研究

■马彩梅 杨金凤 颜雪琴 林祥群

（1.新疆石河子职业技术学院，新疆石河子 832000；2.石河子大学化工学院，新疆石河子 832000）

甘草属豆科植物，含有100多种有效化学成分，大量应用于医药行业，工业上多以提取甘草酸、甘草黄酮、多糖类物质为目的进行生产加工。加工后的固体残渣——甘草渣常被作为废弃物丢弃，从而造成资源的浪费和环境的污染。

为延伸甘草加工产业链，提高甘草附加值，开发功能性饲料，本试验采用饲料级别的酶制剂和酵母分步接种联合发酵甘草渣生产优质粗饲料，研究确定发酵工艺最优条件。

1 材料与方法

1.1 材料

甘草渣：由新疆石河子市国家经济开发区天德中药厂提供。

复合酶（由含22 000 VISCO单位/g木聚糖酶和2 000 AGL单位/gβ-葡聚糖酶，以及纤维素酶、果胶酶等19种酶组合在一起的复合酶制剂），购于北京安瑞博特生物技术有限公司。

活性生香酵母：由沂源康源生物科技有限公司赠送。

1.2 试验方法

1.2.1 甘草渣稀酸预处理方法

取一定量的甘草渣粉，加入10倍1.5%的稀硫酸，混均，120℃处理2 h，处理完毕，用浓NaOH中和至pH值中性，过滤、干燥，再次粉碎过50目筛，做发酵底物。

1.2.2 复合酶水解甘草渣产糖条件选择

称取干燥恒重的预处理后的甘草渣1 g，加入40 ml pH值 4.8的柠檬酸缓冲溶液，调pH值到4.8，121℃灭菌30 min，加入一定量酶，在一定温度、转速、时间、pH值条件下，研究联合发酵对产糖量的影响，做正交试验，确定最佳水解条件。

1.2.3 酵母发酵糖化后甘草渣产蛋白饲料条件选择

以最优产糖条件下水解的甘草渣为底物，通过单因素试验与正交试验确定以蛋白产量为指标的酵母用量、温度、发酵时间。

1.3 分析方法

① 还原糖的测定：采用DNS比色法；②蛋白质测定：采用考马斯亮蓝法；③木质素、纤维素、半纤维素测定：采用Van soest纤维素分析法；④水解率：水解率（%）=总还原糖质量/甘草渣质量（干燥恒重）×100。

2 结果与讨论

2.1 甘草渣主要成分测定

称取一定量的甘草渣，采用范式纤维素分析法测定木质素、纤维素、半纤维素的含量；采用DNS法测定还原糖含量；采用考马斯亮蓝法测定水溶性蛋白质的含量，测定结果见表1。

表1 甘草渣原料主要成分(%)

2.2 标准曲线

移取 1.0 mg/ml的标准葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于试管中，分别加入蒸馏水至1 ml，在上述试管中分别加入DNS试剂2.0 ml，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0 ml，摇匀，在540 nm波长处测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。

由图1可知，DNS法测定的葡萄糖标准曲线线性回归方程为y=0.880 3x+0.007 1，葡萄糖浓度在0.2～1.0 mg/ml范围内线性关系良好。

移取0.1 mg/ml的标准牛血清白蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 ml于试管中，加入蒸馏水至1 ml后，在上述试管中分别加入浓度为0.1 mg/ml的考马斯亮蓝试剂5.0 ml，充分混匀，5 min后在595 nm波长处测定各管吸光度值。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线见图2。

图1 DNS法测定还原糖含量标准曲线

图2 G250法测定蛋白质含量标准曲线

由图2可知，G250法测定蛋白质含量标准曲线线性回归方程式为y=10.045x+0.009 4，可溶性蛋白质浓度在0.01～0.08 mg/ml范围内线性关系良好。

2.3 复合酶水解甘草渣产糖条件选择

复合酶可使甘草渣中纤维素水解生成葡萄糖。通过测定水解后溶液中还原糖的含量，计算纤维素水解率，找出最优水解的条件组合。

2.3.1 酶用量的影响

室温，复合酶用量为30、60、90、120、150、180 mg；水解24 h，过滤，测滤液中还原糖含量。酶用量对水解率影响结果如图3所示。

由图3可知，随着复合酶用量的增加，甘草渣的水解率迅速增加，当酶用量达到120 mg时，产糖量达到最高，水解率达到最大；之后，随着酶用量的增大，产糖量稍有下降，可能是当糖浓度增加到一定水平时，会对酶活性产生抑制。

图3 酶用量与水解率关系

2.3.2 时间的影响

室温下，水解时间分别为12、14、16、18、20、22、24、26、28 h时，离心，取上层清液，测还原糖含量，计算水解率。

时间对水解率的影响结果如图4所示。

图4 时间与水解率关系

由图4可知，水解24 h时，产糖量最高，水解率最大，之后产糖量开始下降，可能是因为随着时间的增长，复合酶体系产生副产物能抑制酶解反应，消耗还原糖，从而导致酶解液还原糖浓度降低。

2.3.3 温度的影响

分别在温度为35、40、45、50、55、60 ℃条件下，水解24 h，测得温度对水解率影响结果如图5所示。

该次研究显示采取激光联合雷珠单抗治疗的研究组治疗有效率为91.18%，不良反应率为11.76%，研究组在临床治疗效果和不良反应率的比较上明显优于对照组（P＜0.05）。综上，采取激光联合雷珠单抗的方法治疗增殖性糖尿病视网膜病变临床效果显著，不良反应率低，值得广泛应用。

在一定范围内，升高温度，酶活性增加，产糖量增加，水解率增大。但温度过高会抑制酶活甚至使酶失活。由图5可知，53～55℃之间水解率较高。

图5 温度与水解率关系

2.3.4 摇床转速的影响

在室温下，摇床转速分别为0、50、100、150、200 r/min时，对水解率影响结果如图6所示。

图6 转速与水解率关系

在一定摇床转速下，酶能充分与甘草渣接触，从而更好地水解被水解物。由图6可知，在50 r/min下水解率较0 r/min要高，但继续提高转速，水解率变化不大。

2.3.5 pH值的影响

室温，pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0时，水解率如图7所示。

pH值过高或过低均会对酶解离状态产生影响。pH值4.5～5.0存在最大水解率。

以产糖量为指标，以影响复合酶水解处理后甘草渣的主要因素：酶用量（A）、温度（B）、pH值（C）、时间（D），进行L9（34）正交试验；转速取50 r/min，因素水平设计见表2，试验结果见表3。

图7 pH值与水解率关系

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验设计和结果

由表3可知，各因素影响顺序为B＞C＞D＞A，复合酶对纤维素水解产糖量影响最大的是温度，最小的是酶用量，由极差值确定最佳条件组合为A2B1C3D1。即1 g甘草渣中加入120 mg复合酶、pH值5.0的缓冲溶液，于52℃、摇床转速50 r/min下水解23 h，产糖量最大，水解率最高。由于正交表中无此组合，故按最佳条件组合平行补三组样，测得产糖量为62.87 mg/g。

2.4 复合酶水解甘草渣最优条件下接酵母产蛋白质最优条件选择

前期样制备：1 g甘草渣中加入120 mg复合酶、40 ml pH值 5.0的缓冲溶液，在52℃、摇床转速50 r/min下，水解23 h后，凉至室温。

2.4.1 酵母用量的影响

在凉至室温的前期样中接入 60、70、80、90、100 mg酵母。24 h后测溶液中蛋白质含量。蛋白质产量与酵母用量的关系如图8。

图8 酵母用量与蛋白质含量的关系

因酵母本身就是由蛋白质组成，故随着酵母加入量的增加，溶液中蛋白质的含量呈上升趋势，经扣除因酵母加入蛋白质含量增加的部分后，酵母加入量为90 mg时，蛋白质含量增长最大。

2.4.2 发酵温度的影响

温度分别为28、30、32、34、36 ℃时，对产蛋白质的影响如图9所示。

图9 温度与蛋白质含量的关系

由图9可知，酵母的生长随着温度的升高而加快，当温度达到一定时，酵母活性下降，蛋白质产量下降。

2.4.3 发酵时间的影响

发酵时间分别为16、18、20、21、22、24 h，对蛋白质产量影响如图10所示。

图10 时间与蛋白质含量的关系

由图10可知，随着发酵时间的延长，碳源逐渐减少，当碳源不足以维持酵母生命时，酵母开始进入衰亡期，蛋白质产量开始下降。

2.4.4 正交试验

以产蛋白含量为指标，以酵母用量（A）、温度(B)、时间（C）为影响因素设计试验。试验因素水平设计见表4，试验结果见表5。前期样制备条件同上，凉至室温，接酵母。

表4 正交试验因素水平

表5 酵母发酵糖化后甘草渣产蛋白饲料的试验设计和结果

由表5可知，各因素影响顺序为A＞C＞B，对蛋白质产量影响最大的是酵母用量，最小的是温度，由极差值确定最佳条件组合为A3B1C2，即每1 g甘草渣制备的前期样，接酵母100 mg、在温度为32℃的条件下发酵21 h。在最优工艺条件下，平行测三次。测得产蛋白质平均值为1.63 mg/g。

2.5 最优工艺下，饲料中主要成分测定

取一定量最优条件下发酵的甘草渣，采用范式法和考马斯亮蓝法分别测定木质纤维素和蛋白质的含量，测定结果见表6。

表6 发酵后甘草渣主要成分(%)

3 结论

①复合酶与酵母分步接种联合发酵稀酸预处理甘草渣最优工艺条件为：1.000 0 g甘草渣中加入120 mg复合酶、40 ml pH值5.0的缓冲溶液、温度52℃、摇床转速50 r/min下、水解23 h后，凉至室温；接酵母100 mg，在温度为32℃的条件下发酵21 h。发酵产物蛋白质增加了2 616.7%、木质素降低了24.2%，纤维素降低了48.43%、半纤维素降低了91.3%。

②发酵产物较原料蓬松，气味酸香，能在一定程度上提高动物的采食量。