水飞蓟宾体外抑制人结肠癌细胞SW480生长和TGF-β诱导的侵袭转移

宋晶晶

（浙江省立同德医院，浙江 杭州310012）

·实验研究·

水飞蓟宾体外抑制人结肠癌细胞SW480生长和TGF-β诱导的侵袭转移

宋晶晶

（浙江省立同德医院，浙江 杭州310012）

目的探讨水飞蓟宾对人结肠癌细胞SW480的生长及对侵袭转移的抑制作用。方法 将人结肠癌细胞SW480用不同浓度的水飞蓟宾治疗后，采用MTT法检测水飞蓟宾对SW480细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测水飞蓟宾是否能诱导SW480细胞凋亡和周期阻滞；将SW480细胞置于2ng/mL的TGF-β中培养，用transwell技术检测水飞蓟宾是否能抑制SW480细胞的侵袭转移能力；Western blot检测肿瘤侵袭力相关蛋白MMP-9和vimentin的表达。结果水飞蓟宾可显著抑制SW480细胞的增殖并使细胞进入G2/M阻滞；水飞蓟宾可显著抑制SW480细胞TGF-β依赖的侵袭转移效应，并降低MMP-9和vimentin的表达。结论水飞蓟宾抑制人结肠癌细胞SW480生长和侵袭转移。

结肠癌；水飞蓟宾；SW480；TGF-β；侵袭转移

水飞蓟宾(silibinin）是水飞蓟素（silymarin）中最主要的生物活性成分，临床上主要用于保肝护肝[1]。近年来，水飞蓟宾还被发现具有抗肿瘤的活性，对于多种肿瘤均具有良好的抑制作用[2-3]，然而对结肠癌细胞生长和转移的抑制作用却很少报道。

本文通过研究水飞蓟宾体外对人结肠癌细胞系

SW480的生物效应，探讨水飞蓟宾对SW480细胞生长及侵袭转移的抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料 本研究于2012年8月~2014年4月在浙江省立同德医院检验实验室完成。人结肠癌SW480细胞系购于美国ATCC(美国模式培养物保藏所），RPMI-1640培养基购于Gibco公司（11875-085），胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程有限公司 （HB0205），transwell小室购于美国Corning公司（3421）；水飞蓟宾（S0417），四甲基偶氮唑蓝（MTT，M2128），Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（APOAF-20TST），碘化丙啶（PI，P4170）购于美国Sigma公司；β-actin（#4967）、MMP-9（#3852）、vimentin抗体 （#3932）购自美国Cell signal公司；BCA试剂盒购于美国Pierce公司（#23227）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人结肠癌SW480细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃含5%的CO2的培养箱中培养，每2~3天传代一次，实验选用对数生长期细胞。

1.2.2细胞增殖抑制试验 将SW480细胞按1× 103/孔接种于96孔板，加入含10%FBS的RPMI-1640培养基200μL，设置3个复孔，实验组分别加入50、100、150、200μmol/L不同浓度的水飞蓟宾培养24、48和72小时，对照组为相同培养条件下不加水飞蓟宾培养。加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4小时。弃上清液，往孔中加150μL二甲基亚砜（DMSO），570nm波长下用酶标仪检测OD值，结果以3次实验的平均值表示。肿瘤细胞生长抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值。

1.2.3细胞周期检测 在SW480细胞培养体系中加入50、100、150、200μmol/L的水飞蓟宾培养24小时，对照组为相同培养条件下不加水飞蓟宾培养。收集细胞，用70%乙醇在4℃固定过夜后用PBS清洗，加入50μg/mL RNA酶，100μg/mL PI在

暗处染色30分钟后用流式细胞仪检测细胞周期，PI的荧光强度表示为细胞DNA的含量，肿瘤细胞的G2/M阻滞可用G2期细胞所占比率表示[4]。

1.2.4细胞凋亡检测 在SW480细胞培养体系中加入50、100、150、200μmol/L的水飞蓟宾培养24小时，对照组为相同培养条件下不加水飞蓟宾培养。收集细胞，按照试剂说明书将PI和Annexin-V加入细胞中孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞越多说明细胞凋亡程度越大。

1.2.5肿瘤细胞侵袭试验 在transwell小室中接种1×104个SW480细胞置于24孔板中，实验组在上室中加入2ng/mL转化生长因子β（TGF-β）及50、100、150和200μmol/L的水飞蓟宾，所用培养基为无血清RPMI-1640，下室培养基为含10%胎牛血清的RPMI-1640。培养24小时后取出transwell小室，用PBS洗去小室内的细胞，将transwell膜用3%多聚甲醛固定15分钟后，用0.1%结晶紫染色20分钟，低倍镜（100倍）观察4个随机选择的区域，计算细胞总数。

1.2.6Western blot试验 SW480细胞培养体系中加入50、100、150、200μmol/L的水飞蓟宾培养24小时，对照组为相同培养条件下不加水飞蓟宾培养。然后用细胞裂解液将细胞裂解后用BCA试剂盒做蛋白定量并将不同实验组调成相等蛋白浓度，Western blot检测波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β-actin的灰度比表示。

1.3统计学处理 所有实验重复3次，实验数据用（）表示，并用SPSS 11.0统计分析软件进行处理，组间比较采用非配对双边t检验以及单因素方差分析。

2 结果

2.1水飞蓟宾对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响 MTT试验结果显示SW480细胞在水飞蓟宾作用下细胞增殖活性受到明显抑制，呈剂量依赖性。48小时和72小时治疗组与24小时治疗组比较，水飞蓟宾对SW480细胞的抑制作用显著增加，表明水飞蓟宾对结肠癌肿瘤细胞的杀伤作用有时间依赖性（表1）。另外，凋亡试验发现水飞蓟宾能诱导SW480细胞发生凋亡 （第77页图2）。这些结果证实了水飞蓟宾具有体外抗结肠癌作用。

表1 水飞蓟宾对SW480细胞的抑制作用（）

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与同浓度水飞蓟宾组治疗24小时抑制率比较△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n/孔对照组 30 0 0 50μmol/L水飞蓟宾组 3 4.1±1.1 9.5±2.8*19.3±3.9**△100μmol/L水飞蓟宾组 3 14.5±3.7*32.8±4.7**△△44.5±4.9**△△150μmol/L水飞蓟宾组 3 28.4±4.1**47.5±5.6**△△71.2±6.6**△△200μmol/L水飞蓟宾组 3 42.5±6.3**72.4±5.9**△△89.4±7.5**△△抑制率（%）24h 48h 72h

2.2水飞蓟宾诱导SW480细胞周期进入G2/M阻滞 细胞周期的阻滞将抑制肿瘤细胞的增殖，随着水飞蓟宾剂量的增加，进入G2期的SW480细胞比例显著增加（表2），表明水飞蓟宾对SW480细胞有G2/M阻滞作用，使肿瘤细胞的增殖周期停滞，从而抑制和杀伤结肠癌肿瘤细胞。

表2 水飞蓟宾对SW480细胞周期的生物效应（）

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别 n/孔 G2/M阻滞（%）对照组 3 2.4±0.4 50μmol/L水飞蓟宾组 3 4.6±0.9 100μmol/L水飞蓟宾组 3 7.7±1.5*150μmol/L水飞蓟宾组 3 18.7±3.3**200μmol/L水飞蓟宾组 3 26.8±4.8**

2.3水飞蓟宾抑制TGF-β诱导的结肠癌细胞侵袭转移 为了研究水飞蓟宾对SW480细胞侵袭和

转移的抑制作用，将SW480细胞接种于transwell小室中，并在无血清条件下加入TGF-β模拟体内的肿瘤侵袭过程。将SW480细胞用不同浓度的水飞蓟宾治疗24小时，显微镜计数transwell膜上的细胞数，测定SW480细胞的侵袭能力。结果发现随着水飞蓟宾剂量的增加，transwell膜上的细胞数显著减少（表3），表明水飞蓟宾能抑制结肠癌细胞的侵袭和转移。为了在蛋白水平上进一步研究水飞蓟宾对SW480细胞侵袭能力的影响，用Western blot法检测TGF-β依赖肿瘤侵袭相关蛋白vimentin和MMP-9的表达，结果发现随着水飞蓟宾剂量的增加，vimentin和MMP-9的表达降低，详见图1。这些实验结果提示水飞蓟宾通过下调SW480细胞vimentin和MMP-9的表达抑制TGF-β诱导的肿瘤侵袭能力。

表3 水飞蓟宾对SW480细胞侵袭能力的抑制作用（）

与TGF-β组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别n/孔 细胞数（个） 灰度比（vimentin/β-actin） 灰度比（MMP-9/β-actin）对照组3187±480.35±0.060.30±0.05 TGF-β组3665±830.89±0.150.78±0.11 50μmol/L水飞蓟宾+TGF-β组3598±890.81±0.130.70±0.12 100μmol/L水飞蓟宾+TGF-β组3421±65**0.67±0.12*0.57±0.09*150μmol/L水飞蓟宾+TGF-β组3219±42**0.38±0.08**0.41±0.06**200μmol/L水飞蓟宾+TGF-β组3146±39**0.31±0.04**0.34±0.05**

3 讨论

近年来，由于人们饮食习惯和生活方式的改变，结肠癌发病率逐年上升，已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和致死率居第二位[5]。因此研究新的治疗结肠癌的药物具有重要意义。在本研究中，作者通过MTT法和细胞周期试验发现水飞蓟宾具有良好的体外抗结肠癌生长的作用，而Annexin V染色法实验结果则发现水飞蓟宾还能诱导肿瘤细胞发生凋亡，这些结果都提示了水飞蓟宾良好的抗肿瘤活性。

致癌基因的表达及细胞微环境的变化使组织上皮细胞逐渐癌变形成癌细胞，在肿瘤发展过程中癌细胞逐渐失去上皮细胞特征并获得间充质细胞特性，这一过程称之为上皮细胞间质转型（EMT）。通过EMT，肿瘤细胞获得侵袭正常组织的能力，并向周边组织逐渐形成转移灶，它是肿瘤侵袭转移的关键过程，是肿瘤的发展和致死的关键因素[6-7]。在结肠癌的发展过程中，肿瘤细胞微环境中的TGF-β对肿瘤的侵袭和转移起着关键的调节作用。肿瘤细胞内核转录因子Smad4功能的失活使TGF-β从肿瘤抑制因子转变为肿瘤促进因子，并通过信号转导通路上调间充质细胞骨架蛋白如vimentin及MMP-9等的表达促进结肠癌细胞的侵袭转移能力[8-10]。而在本研究中，作者通过transwell试验发现水飞蓟宾可有效抑制TGF-β诱导SW480侵袭转移能力，而Western blot试验则提示其抑制肿瘤细胞转移能力的机制可能为下调SW480细胞MMP-9和vimentin的表达。

综上所述，水飞蓟宾具有良好的结肠癌细胞抑制活性并能显著抑制TGF-β诱导的肿瘤侵袭转移，为水飞蓟宾治疗结肠癌提供了理论依据。

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