外周血miRNA与胃癌早期诊断相关研究进展

张袁骕 裘华森★ 程向东 徐志远

·综述·

外周血miRNA与胃癌早期诊断相关研究进展

张袁骕 裘华森★ 程向东 徐志远

胃癌（Gastric Cancer）在我国恶性肿瘤发病率和病死率均排在第2位，目前主要依靠早期明确诊断和手术相结合的方法提高胃癌患者的生存率，且按TNM分期标准，经个体化综合治疗后Ⅲ、Ⅳ期患者的5年生存率显著低于I、II期［1］。＞80%胃癌患者中晚期才被确诊，因此有必要探索一种新的特异性和敏感性高的肿瘤标记物应用于胃癌的早期诊断。目前外周血中可用的胃癌标记物主要有AFP、CEA、CA-125和CA-199等对于进展期胃癌诊断有较高的敏感性，而对于早期胃癌诊断却无明显的差异［2］。近年关于miRNA的研究表明，外周血MicroRNA（miRNA）的种类及表达水平在癌症和其他疾病的状态下出现显著的改变，且外周血miRNAs作为胃癌等肿瘤诊断标记物的研究逐渐成为新的研究热点。

1　外周血miRNAs

miRNA是在动植物中发现的一类内源性的起重要调控功能的非编码RNA，其大小约＜22个核苷酸［3］。大多数miRNAs是经RNA聚合酶II初步转录后的长链miRNA（primiRNA），pri-miRNAs再经过两次连续的酶促（Drosha酶和Dicer酶）裂解反应。成熟的miRNAs主要通过脱腺苷化促进目标miRNAs裂解或抑制翻译对基因转录后表达起到调控作用［4］。

1.1外周血miRNAs特性 尽管miRNAs的生物功能并未被完全了解，但miRNAs的分析显示大部分类型肿瘤的表达谱与正常组织之间存在显著差异。因此，miRNAs作为一类高度组织特异性生物标记物，在各类诊断实验中用于临床诊断肿瘤的组织来源［5］。由于血清中存在大量核糖核酸酶（RNase），因此推理血清中不应该有完整的RNA。但研究结果却表明miRNAs与已知的循环核酸一样稳定，可在室温下24h或8次冻融后仍保持稳定，并广泛存在于人类外周血、尿液等外周循环中。Li等［6］研究，miRNAs经不同条 件（包括不同温度、持续时间、pH值、RNase A消化、DNase I消化及各种冻融循环）处理后，使用qRT-PCR分析后显示肿瘤相关miRNAs仍可被检测到，表明miRNAs极其稳定并可抵抗严酷环境引起的破坏和降解。Mitchell等［7］通过建立异种移植获得的miRNAs与外周血miRNAs对照试验，并进行TaqMan qRT-PCR定量检测显示外周血miRNAs的分子结构具有一定对抗RNase的能力。

1.2外周血miRNAs作为生物标志物 一种新的有效的生物标志物也有助于肿瘤的诊断和临床管理，最佳的生物标志物是可以通过无创伤的方式且易于获取的。由于外周血miRNAs在不同温度、酸碱环境及物理状态等条件下仍能维持稳定，且外周血miRNAs有一定的组织特异性，因此检测肿瘤患者的外周血miRNAs表达情况并从中筛选出可用于诊断胃癌等恶性肿瘤的生物标志物。Lawrie等［8］研究第一次发现肿瘤特异性的外周血miRNAs，miRNA-21在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中高度表达。Ng等［9］应用qRT-PCR分别对结肠癌细胞、癌旁正常结肠组织、患者血浆和健康对照组的miRNAs表达谱进行分析，该实验显示5种miRNAs在肿瘤细胞及肿瘤患者血浆中相对于健康志愿者存在明显的过表达，同样外周血miRNAs也被分析用于早期癌症诊断的可行性。Huang等［10］研究早期结肠癌患者外周血中miRNAs表达情况，其中miR-29a和miR-92a用于区别早期结肠癌和健康人群有83.0%的敏感性和84.7%的特异性。这些数据均表明非细胞的miRNAs可潜 在用于癌症的早期诊断。这类 新的生物标志物对于癌症早期这一无症状阶段的诊断有十分重要的意义。

1.3外周血miRNAs提取及检测方法 由于外周血中RNA含量较低且miRNAs一般只占1%～5%［3］，所以需要尽可能将miRNAs浓缩至一个较小的体积以提高浓度，从而进行下一步实验检测。目前公认提取外周血中miRNAs较为有效的试剂盒有Ambion公司的mir Vana PARIS K it和Qiagen公司的miRNeasy kit，但现在仍无针对大批量外周血样本进行有效提取的方案［11］。根据不同研究目的对miRNAs定量检测方法主要有以下几种：Northern印迹法、核糖核酸酶保护分析（RPA）、基因芯片技术和RT-PCR。Northern印迹法对设备与技术要求相对简单，是miRNA分析的常用方法，但其传统基因探针敏感性不高、耗时相对较长和对样本中miRNAs的浓度有一定要求等缺点，限制其用于外周血miRNAs检测应用。核糖核酸酶保护分析（RPA）是近10年发展起来的一种全新的miRNAs定量分析方法，以灵敏、准确和高通量为特征，在国外广泛应用于miRNAs分析研究，但由于其价格原因未在国内普遍使用。基因芯片技术（microarrays）适用于大量筛选且检测速度较快，但设备、样本制作要求高，目前多用于前期筛选工作，未能在实验室和临床中广泛应用。对于外周血miRNAs的检测目前主要依赖于RT-PCR，包括poly（A）加尾RT-PCR法、探针RTPCR方法和颈环RT-PCR法，其中poly（A）加尾RT-PCR法因其经济、时效等特点为目前较为常用的实时定量PCR检测方法。

2　miRNAs与胃癌

2.1幽门螺杆菌感染相关miRNAs 大量研究证明幽门螺杆菌（HP）感染对胃癌的发生存在显著影响，根据Eurogast小组研究结果显示HP感染人群胃癌发病率相对未感染人群增加6倍。WHO也将其列为胃癌的I类致癌原。多项研究［12，13］表明HP感染根治者相对感染者在慢性萎缩性胃炎、肠化生、异型性增生和胃癌的发病率上有显著的减少，提示HP感染在胃癌的发生、发展过程中存在一定作用。目前认为胃癌多是由HP感染等致病原导致的慢性炎症所引起，检测并分析HP感染胃组织、正常组织以及胃癌组织之间miRNAs的表达差异，有助于明确miRNAs在胃癌发生及进展过程中的机制和作用。Zhang等［14］分别对感染HP的胃黏膜组织、正常胃黏膜、人胃腺癌细胞（AGS细胞）及胃癌组织的miRNAs表达谱进行检测，通过RT-PCR技术证实miR-21在AGS细胞、感染HP的胃黏膜及胃癌组织中表达均显著升高，表明miR-21过表达的胃癌部分是源于HP感染。且进一步研究证实miR-21通过下调RECK（抑癌基因）的表达，从而导致胃癌的发生。最近研究发现miR-21还可以抑制一种新的抑癌蛋白—程序性细胞凋亡因子4（PDCD4），其在胃癌患者中表达明显下降，并且肿瘤的大小、分化程度、淋巴结转移、血管浸润和临床预后不佳与miR-21高表达和PDCD4低表达有关，miR-106a高表达时也存在类似现象。有研究［15］表明HP感染可诱导miR-124发生甲基化使其沉默转变为miR-124a，且胃癌组织中miRNAs甲基化的比例显著升高。Hayashi等［16］研究认为，HP细胞毒素相关蛋白A（CagA）在体内外均可以通过对蛋白组修饰和DNA甲基化等方式引起let-7基因异常的表现遗传沉默，从而激活Ras信号通路导致胃癌发生。这些均表明HP感染与胃癌的发生发展存在一定的联系。

2.2miRNAs与早期胃癌诊断 胃癌和大多数肿瘤一样，尽量做到早期发现，但目前早期诊断仍然比较困难。大部分胃癌患者早期无明显的异常感，且尚无有效的常规临床筛查方法，常明确诊断时多发展至中位生存期只有7～9个月的晚期胃癌［17］。因此确立一种规范的早期胃癌诊断及管理方式应作为胃癌相关研究的长期目标。近年来，学者们着手研究外周血中miRNAs作为早期胃癌标记物的可行性。例如，血清中miR-375表达与胃癌组织中一样明显下调，ROC曲线下面积（AUC）为0. 835，在区别远端胃腺癌与健康对照组之间的敏感性和特异性分别为85%和80%［18］。MiR-421在胃癌组织表达明显上升，且与胃癌临床症状之间无明显关系，该miRNA可能与早期胃癌发生有关［19］。由于miR-421检测胃癌的阳性率明显高于血清癌胚抗原，可作为有效的早期胃癌生物标记物。Song等［20］研究中16种血清miRNAs与对照组表达比较明显上调，其中miR-221， miR-744和miR-376c采用ROC曲线判断敏感性和特异性分别为82.4%和58.8%，且miR-221和 miR-376c与胃癌的分化程度呈负相关。Liu等［21］应用miRNA芯片技术对早期胃癌患者和健康对照组血浆中miRNAs进行研究发现miR-187， miR-371-5p和miR-378表达提高，进一步对miR-378分析得出ROC曲线下面积（AUC）为0.861，87.5%的敏感性和70.73%的特异性。国芳等［22］也对血清中miRNAs进行研究，通过qRTPCR分析得出早期胃癌中miR-1和miR-20a的表达明显升高（P＜0.05），ROC曲线下面积（AUC）分别为0.8138和0.7742，两者联合的AUC为0.8653，敏感性和特异性分别为80.5%和83.6%，进展期胃癌中miR-1的表达显著高于早期胃癌（P=0.0121）。这些研究数据进一步支持miRNAs作为潜在的胃癌标记物，有助于早期明确诊断，包括胃癌类型、部位、浸润程度等并予以及时治疗，从而降低胃癌患者的病死率。

3　总结与展望

近年来miRNAs成为胃癌等恶性肿瘤研究的热点，且大量研究均证实其为潜在的胃癌诊断标记物。但其仍有分析方法和技术的局限性，例如各种发表的研究报道中不同的检测方法种类、分析软件及标准化指标。因此，确立一种标准化的提取及检测方法及观察指标是未来胃癌相关miRNAs的一种研究趋势。尽管miRNAs已被证明与胃癌相关，但由于不同的患者之间存在的个体差异，即使相同类型的癌症，仅使用一个生物标记物作为确定其癌症状态的可靠性仍存在疑问。为此几种miRNAs的唯一组合可以有效地用于诊断目的。例如，在肝硬化患者中观察到的miR-106b低表达和miR-181b高表达，其ROC曲线下面积（AUC）分别为0.715 和0.833，而两者联合的AUC为0.882。这些数据证明了miR-106b和miR-181b的联合检测对肝硬化患者具有更大的临床诊断价值［23］。因此，一个生物标记物的集合对应一种疾病可能成为一种拥有更高灵敏度，特异性和准确性的诊断工具。

随着科研技术的不断发展，外周血miRNAs的提取及检测方法将趋于简化，进一步大规模调查及验证miRNAs作为常规的临床检验及无创性筛查工具是必要的，不再局限于实验研究中，而是可以应用于临床诊断中，将其列入生物标志物以提升早期胃癌诊断和预后。

1 任意， 付蔚华， 李卫东.胃癌TNM 分期的临床应用.中国中西医结合外科杂志，2012，18（2）：114～116.

2 He C-Z， Zhang K-H， Li Q， et al.Combined use of AFP， CEA， CA125 and CAl9-9 improves the sensitivity for the diagnosis of gastric cancer. BMC gastroenterology，2013，13（1）：87.

3 Bartel DP.MicroRNAs： genomics biogenesis mechanism and function. cell，2004，116（2）：281～297.

4 Fabian MR， Sonenberg N， Filipowicz W.Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.Annual review of biochemistry，2010，79：351～379.

5 Volinia S， Calin GA， Liu C-G， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（7）：2257～2261.

6 Li Y， Jiang Z， Xu L， et al.Stability analysis of liver cancer-related microRNAs.Acta biochimica et biophysica Sinica，2011，43（1）：69～78.

7 Mitchell PS， Parkin RK， Kroh EM， et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proceedings of the National Academy o f Sciences，2008，105（30）：10513～10518.

8 Lawrie CH， Gal S， Dunlop HM， et al.Detection of elevat ed levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.British journal of haematology，2008，141（5）：672～675.

9 Ayaz L， Görür A， Yaroğl u HY， et al.Differential expression ofmicroRNAs in plasma of patients with laryngeal squamous cell carcinoma：potential early-detection markers for laryngeal squamous cell carcinoma. Journal of cancer research and clinical oncology，2013，139（9）：149 9～1506.

10 Huang Z， Huang D， Ni S， et al.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer.International journal of cancer Journal international du cancer，2010，127（1）：118～126.

11 Kro h EM， Parkin RK， Mitchell PS， et al.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR （qRT-PCR）.Methods，2010，50（4）：298～301.

12 You W-c， Brown LM， Zhang L， et al.Randomized doubleblind factorial trial of three treatments to reduce the prevalence of precancerous gastric lesi ons.Journal of the National Cancer Institute，2006，98（14）：974～983.

13 Leung W， Lin S， Ching J， et al.Factors predicting progression of gastric intestinal metaplasia： results of a randomised trial on Helicobact er pylori eradication.Gut，2004，53（9）：1244～1249.

14 Zhang Z， Li Z， Gao C， et al.miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression.Laboratory investigation， 2008，88（12）：1358～66.

15 Ando T， Yoshida T， Enomoto S， et al.DNA methylation of microRNA genes in ga stric mucosae of gastric cancer patients： its possible involvement in the formation of epigenetic field defect.International Journal of Cancer，2009，124（10）：2367～2374.

16 Hayashi Y， Tsujii M， Jun W， et al.CagA mediates epigenetic regulation to attenuate let-7 expression in Helicobacter pylori-related carcinogenesis.Gut Online，2012：62（11）1136.

17 Wagner AD， Grothe W， Haerting J， et al.Chemotherapy in advanced gastric cancer： a systematic review and meta-analysis based on aggregate data.Journal of Clinical Oncology，2006，24（18）：2903～2909.

18 Zhang W-H， Gui J-H， Wang C-Z， et al.The identification of miR-375 as a potential biomarker in distal gastric adenocarcinoma. Oncology Research Featuring Preclinical and Clinical Cancer Therape utics，2012，20（4）：139～147.

19 Jiang Z， Guo J， Xiao B， et al.Increased ex pression of miR-421 in human gastric carcinoma and its clinical association.Journal of gastroen terology，2010，45（1）：17～23.

20 Song M-y， Pan K-f， Su H-j， e t al.Identification of serum microRNAs as novel non-invasive biomarkers for early detection of gastric cancer. PloS one，2012，7（3）：e33608.

21 Liu H， Zhu L， Liu B， et al.Genome-wide microRNA profiles identify miR-378 as a serum biomarker for early d etection of gastric cancer. Cancer letters，2012，316（2）：196～203.

22 国芳， 姚玮艳， 戴欣， 等.血清 miRNA 作为胃癌早期诊断标记物的初步研究.胃肠病学，2014，19（4）：198～202.

23 Chen Y-J， Zhu J-M， Wu H， et al.Circ ulating microRNAs as a fingerprint for liver cirrhosis.PloS one，2013，8（6）：e66577.

浙江省中医药重点研究计划（2012ZZ002）

310022 浙江中医药大学