糖原合成激酶-3在心血管疾病中的研究进展

李金，唐其柱，张文斌，胡哲夫，向仕钊，刘高瞻

· 综述 ·

糖原合成激酶-3在心血管疾病中的研究进展

李金，唐其柱，张文斌，胡哲夫，向仕钊，刘高瞻

糖原合成激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）在体内广泛表达，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，在1980年其首次被确认具有调控糖原合成的作用，是一种糖原合成的限制酶。基于部分肽链的测序结果，在1990年GSK-3第一次被克隆合成[1]。GSK-3高度保守，在其蛋白激酶结构域上苍蝇和人类显示＞90%同源性序列[2]。GSK-3家族已知有两个亚型为GSK-3α（51KD）和GSK-3β（47KD），二者激酶结构域有98%的同源性，而其激酶结构域非常高的同源性也限制了各亚型特异性的小分子抑制剂发展前景。大量研究表明GSK-3参与调控多种心血管疾病的病理过程，如心肌老化、心肌细胞增殖、缺血性损伤与心肌肥厚及纤维化。因此本文重点阐述GSK-3各异构体生物化学特征，及其在心血管疾病中的作用。

1 GSK-3异构体的功能差异

尽管GSK-3的各亚型功能相似，但也有部分不同：①只有GSK-3β亚型可ser389/thr390位点磷酸化；② GSK-3β具有特异性的神经元剪接插入位点AA-13。GSK-3各异构体除上述差异外，两种亚型敲除的表型也不同，如GSK-3β全身敲除小鼠是胚胎致死性，但GSK-3α敲除小鼠出生时正常，且存活几年。两种异构体也有各自的信号转导机制，缺失GSK-3β的细胞抑制核因子κB的激活，而敲除GSK-3α的细胞无明显变化。与多数的蛋白激酶不同，在静息状态细胞中GSK-3通常处于活化状态，受到各种刺激后失活。GSK-3可通过N-末端的丝氨酸残基磷酸化而参与负性调控，且GSK-3α的修饰位点为Ser21，GSK-3β的修饰位点为Ser9。除了上述的调控方式，GSK-3的活性还可通过酪氨酸的磷酸化而呈正性调控（GSK-3α为Tyr 279，GSK-3β为Tyr216）[2-4]。P38MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）也使GSK-3β的C-末端区域（Ser389和Thr390）磷酸化而失活[5]。在心肌病理生理学中GSK-3的Ser21和Ser9位点磷酸化的作用已经有所报道[6-9]，但酪氨酸磷酸化和P38介导的C-末端磷酸化的生理意义尚不清楚。

GSK-3最初体外研究是关于心肌肥厚方面的，并确定了GSK-3β为心肌肥厚的负性调控因子[10]，且以往对GSK-3家族的研究主要集中在GSK-3β。随着对GSK-3研究的深入，对GSK-3α的认识也逐渐加深。近年研究GSK-3各亚型特异性条件性基因敲除结果提示，二者功能相似，甚至有时相反。最近研究发现在心肌梗死后，心肌细胞特异性敲除GSK-3α具有保护作用，提示以GSK-3α为特异性靶点治疗是一种新的抑制缺血性心脏发生心肌重构的治疗策略。然而，应用胚胎性GSK-3α基因敲除的研究发现，GSK-3α的缺失可导致自发性心肌肥厚[11]，加重心肌梗死后引起的重构[12]，加速年龄相关的心肌老化[13]。最近也有研究显示在缺血性心脏中GSK-3β参与负性调控心肌纤维化重构，其机制与调控转化生长因子β1（TGF-β1）-SMAD3信号通路有关，同时也发现在缺血性心脏中GSK-3β介导的负性调控纤维化是抑制心室重构的必要通路[14]。

2 GSK-3α与心脏生理

大量研究显示GSK-3β在心脏中的重要作用[4,14,15]，而GSK-3α在心脏生理中的作用了解甚少[16]。在心肌梗死与压力超负荷的模型中发现，GSK-3α基因敲除加重心室重构和心力衰竭[11,12]。也有研究报道GSK-3α基因敲除小鼠会加重心肌肥厚、纤维化与心力衰竭[6]。GSK-3α在心脏中的生理作用较复杂，仍待继续探索。

3 GSK-3α与心肌肥厚及纤维化

心肌细胞为终末分化细胞，受到各种生理（如运动）和病理（如高血压）的刺激会变得肥大，最终导致心肌肥厚。生理性肥厚可改善心脏功能，如每搏输出量会增加和氧耗量增大；然而，病理性肥厚时会重新启动胚胎基因的表达，因而增加细胞死亡、心肌纤维化与心功能不全，最终导致心力衰竭。

GSK-3α敲除小鼠的实验表明，在正常与应激时，GSK-3α 是心肌肥厚与纤维化的负性调控因子[11,12]。哺乳动物雷帕霉素1（mTORC1）是GSK-3α参与调节心肌肥厚的一个关键调控靶点。研究还发现，在GSK-3α敲除的小鼠中还可增加mTORC1下游的磷酸化水平，如eIF4E结合蛋白和核糖体S6激酶[11]。GSK-3α转基因的小鼠由于细胞凋亡增加与心肌纤维化而导致心脏体积变小，但心脏仍维持着基础功能。在压力超负荷诱导下，小鼠的心肌肥厚表型不明显，但凋亡与纤维化仍增加，最终导致心室功能明显降低[17]。压力超负荷应激情况下，GSK-3α基因过表达小鼠可出现明显的病理性心肌肥厚、纤维化与心室功能不全[6]。在小鼠心肌梗死模型中，GSK-3α基因条件性敲除小鼠心肌梗死后重构、心室功能障碍和心力衰竭减轻[18]。

4 GSK-3α与心肌细胞增殖

新生心脏具有再生能力[19]，哺乳动物的成年心脏被认为是终末分化器官[20]。各种应激压力，尤其是缺血性损伤，可导致渐进性地心肌细胞缺失。心肌梗死后患者的心肌细胞缺失，导致疤痕形成，收缩能力下降和心脏功能降低。生理情况下，心肌细胞增殖水平较低，但在应激条件下，增殖会轻度增加[21-23]。如果成人心脏受损，心肌细胞再生能力不能代偿损失的心肌细胞。因此即使相对较低的凋亡水平也影响心脏功能[24]。

有研究显示GSK-3β有效调节细胞的增殖[15,25]。近年也发现GSK-3α持续激活会抑制心肌细胞增殖[6]。此外，研究显示GSK-3α基因过表达小鼠的心脏在压力超负荷下，细胞周期与细胞增殖相关的基因表达明显下调。GSK-3α持续激活抑制E2F转录因子，可能与心肌细胞中的D-型细胞周期蛋白有关[18]。与此一致的是，在心肌梗死模型中，GSK-3α敲除具有心脏保护作用，具体表现为促进心肌细胞增殖，防止疤痕扩张及心脏变薄。

在成人受损的心脏中GSK-3α缺失可诱导心肌细胞增殖，具体表现为Ki67和BrdU阳性细胞数增加。GSK-3α基因敲除小鼠心梗后，心脏E2F-1和细胞周期蛋白E1（cyclinE1）表达上调，E2F-1和cyclinE1表达上调是心肌细胞增殖的重要机制[18]。综上所述，在心梗中GSK-3α可抑制心室重构和改善心脏功能。

5 GSK-3β与心肌肥厚

Haq等[10]和Morisco等[26]首次发现GSK-3β为心肌肥厚的负性调控因子，在心肌细胞中腺病毒基因转染GSK-3β-S9A可抑制α-肾上腺素、β-肾上腺素与内皮素-1诱导的心肌肥大。在细胞研究的基础上，转基因动物模型也进一步证实了此结果。

Olson等[7]构建了心脏特异性过表达GSK-3β的转基因小鼠，发现心脏特异性过表达GSK-3β可减弱因β-肾上腺素与压力超负荷所诱导的心肌肥厚。提示，心脏GSK-3β活性的提高可为治疗病理性肥大提供临床效益。

研究发现，GSK-3β转基因小鼠出生后心肌细胞生长出现障碍，导致心肌细胞钙代谢受损及收缩功能异常[27]。为验证在正常和压力超负荷下GSK-3β持续失活对心脏的影响，应用了GSK-3β基因失活小鼠，发现在基线水平上抑制GSK-3β可诱导代偿性心肌肥厚，与生理性肥厚相似，可促进心脏功能；在压力超负荷下抑制GSK-3β也具有心脏保护作用，其机制与抑制细胞凋亡和纤维化有关。

应用心肌细胞基因敲除模型阐释了GSK-3β在病理性肥大中的作用，因此推测GSK-3β条件性基因敲除的小鼠在压力超负荷下会有明显的心肌肥厚。但GSK-3β基因敲除却对基础或主动脉缩窄诱导的病理性肥厚无明显作用[28]。此外，野生型与GSK-3β基因敲除小鼠中也没有发现任何心功能差异。而在缺血性心脏中GSK-3β是调控心肌肥厚的主要异构体，且这种肥厚是生理型肥厚。这项研究表明，在主动脉缩窄压力超负荷诱导的心肌肥厚中，GSK-3β不是中心调节器。

6 GSK-3β与心肌细胞增殖

在野生型胚胎干细胞（ES）基础上敲除GSK-3α或GSK-3β形成拟胚体（EBs），研究发现，与野生型相比，GSK-3α KO的心肌细胞有轻微的分化障碍。然而GSK-3β KO的EBs增殖在体积和数量上显著增加，提示在GSK-3β KO的EBs中心肌细胞分化能力明显减弱，且这种异常与参与促进细胞增殖的典型因子（如GATA，cyclinD1和c-Myc）有关。重要的是，在GSK-3β KO的EBs中β-连环蛋白（β-catenin)/Wnt信号通路并未受到影响。同样，在GSK-3β KO与野生型小鼠中GATA4和Nkx2.5也无明显变化[15]。

GSK-3αKO小鼠的出生是在预期的频率，且出生后没有观察到明显的心脏发育缺陷，但GSK-3β KO却未观察到活产小鼠。GSK-3β KO小鼠胚胎在发育过程中可观察到明显的肥厚性心肌病，及由于心肌细胞增殖导致附近的心室腔闭塞；先天性心脏畸形，如右心室双出口和室间隔缺陷较少见。同时，在胚胎发育过程中心肌细胞分化明显受损和心肌细胞明显增生。

为确定其机制，用Edu染色的方法检测了心肌细胞的增殖，发现心肌细胞增殖明显增加，因此提示心肌肥厚为细胞的增殖并非病理性肥厚。GSK-3β与在胚胎心脏生长发育起关键作用的GATA4，cyclinD1和c-myc共同调控心脏的生长与发育。总之，GSK-3β是一种胚胎期心肌细胞增殖、分化及流出道发育的关键调控酶。

7 GSK-3β与心肌纤维化

纤维化有侵袭性，最终导致器官功能不全和死亡[29]。心脏疾病与成纤维细胞的激活和增殖相关，成纤维细胞是细胞外基质（ECM）与纤维化的主要来源[30]。目前临床还没有批准的靶向治疗纤维化的药物。最近的研究表明，成纤维细胞在心肌疾病的发病过程中发挥促进作用，例如，在压力超负荷下诱导的心肌肥厚小鼠模型中与心肌梗死后引起的心肌重构小鼠模型中，都发挥着重要的作用[14,31,32]。Takeda等[31]第一次用Cre重组酶技术清晰地表明了心脏成纤维细胞在压力超负荷下是心脏适应性反应所必不可少的。已有多项研究表明GSK-3β在心肌细胞的生理学和疾病中的作用，被认为是一个心肌肥大的负性调节因子[6,10,15,27]。有研究表明GSK-3β基因的缺失可使纤维化TGF-β1-SMAD-3信号通路过度激活，最终导致心肌梗死后的过度纤维化和心室重构，且GSK-3β也参与调控成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化[33,34]。应用成纤维细胞特异性GSK-3β KO小鼠研究发现GSK-3β基因缺失，尤其在心脏成纤维细胞，导致缺血后的心脏纤维化和疤痕程度更明显。GSK-3β缺失也可诱导一些成纤维细胞，如孤立的心脏成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和心肌梗死后的成纤维细胞，向促纤维化的肌成纤维细胞表型转化。

8 GSK-3β与纤维化的分子机制

在健康的心脏中，GSK-3β可防止心脏的纤维化和损伤。GSK-3β发挥抑制成纤维细胞激活和纤维化基因表达的作用，具体机制：β-catenin依赖的机制和TGF-β1-SMAD-3依赖的机制。

GSK-3β是Wnt/frizzled信号转导通路的核心组成部分，β-catenin作为其第二信使[35]。Wnt信号通路的组成与分子机制已经有广泛的研究。GSK-3β为降解复合物的必要组成成分，且GSK-3β使β-catenin通过泛素化和蛋白酶体降解途径而降解，其缺失导致β-catenin在细胞质中积累，从胞质进入胞核，进而共同激活靶基因的转录。

TGF-β1是至今发现的最有效的促纤维化细胞因子，是成纤维细胞激活的关键介质，在纤维化疾病中驱动细胞外基质异常合成。TGF-β1信号通路主要通过SMAD依赖的经典途径和SMAD非依赖（非经典）的途径。在SMAD依赖的途径中，活化的TGF-β2型受体激活TGF-β1型受体，进而TGF-β1型受体使转录因子SMAD2/3磷酸化，磷酸化的SMAD2/3结合SMAD4后一起从胞质向细胞核转位，进行随后的转录调控。

在TGF-β信号通路中SMAD2/3的磷酸化和核转位是一个限速步骤，是信号和生物反应的强度和持续时间决定因素[36]。最近有研究表明GSK-3β通过负调控SMAD-3的活性而发挥抗纤维化的作用。Guo等[36]报道GSK-3β通过控制SMAD-3蛋白稳定性来调控TGF-β1信号，研究表明在不影响TGF-β受体或SMAD-2情况下，减少GSK-3β的表达或活性会增加SMAD-3的稳定性和转录活性。与此相反，过表达GSK-3β可促进SMAD-3的基础降解，且可降低细胞对TGF-β的敏感性[37]。然而，这些研究都是在细胞系或分离的原代细胞上进行的，有一定局限性。有研究发现SMAD-3小分子抑制剂可明显减弱疤痕，几乎抑制因心脏成纤维细胞GSK-3β基因敲除而引起的不良表型，具体表现为恢复心脏功能和室腔的大小。总之，这些结果表明，在心脏成纤维细胞GSK-3β基因敲除或选择性抑制SMAD-3的过度激活是有害的。此外，这些研究证明了GSK-3β在人类心脏和心脏成纤维细胞中与SMAD-3有直接相互作用，GSK-3β的抑制或敲除可增加SMAD-3在羧基端（S423/425）磷酸化水平和降低N末端（S204）磷酸化水平。因此，GSK-3β在TGF-β1-SMAD-3信号通路中发挥重要的作用，抑制或敲除GSK-3β可激活SMAD信号通路而诱导纤维化。

9 展望

GSK-3α/β在心脏生物学发挥重要功能，如心脏修复、再生、纤维化等，且GSK-3的异构体在不同的心脏模型中发挥着复杂作用，靶向治疗难度较高。最近的研究发现，心肌细胞GSK-3α基因敲除在缺血性心脏中具有保护作用，因此在心梗患者中，缺血性区域GSK-3α可作为主要的治疗靶点，特别是对于血运重建不完全或梗死面积较大的患者。但目前所有的GSK-3靶向药物对亚型异构体不具有特异选择性，且长期使用可能有害。然而在I/R损伤患者中，对GSK-3局部或短期的抑制可能获益。为了获得靶向药物，小分子抑制剂的作用靶点针对GSK-3α和GSK-3β异构体的特定靶向区域。另外，也可以应用RNA小分子干扰和单克隆抗体技术，但需要合适的干预途径和治疗时间点。研究认为有必要实施更多对GSK-3小分子抑制剂的研究，为其进入临床治疗心血管疾病提供依据，但目前还未发现GSK-3小分子抑制剂治疗心血管疾病的临床试验。由于临床上应用非特异性异构体抑制剂可能会导致心肌纤维化重构，因此研发选择性的GSK-3小分子抑制剂已迫在眉睫。

[1] Woodgett JR. Molecular cloning and expression of glycogen synthase kinase-3/factor A[J]. EMBO J,1990,9(8):2431-8.

[2] Hughes K,Nikolakaki E,Plyte SE,et al. Modulation of the glycogen synthase kinase-3 family by tyrosine phosphorylation[J]. EMBO J,1993,12(2):803-8.

[3] Lochhead PA,Kinstrie R,Sibbet G,et al. A chaperone-dependent GSK3beta transitional intermediate mediates activation-loop autophosphorylation[J]. Mol Cell,2006,24(4):627-33.

[4] Kirk JA,Holewinski RJ,Kooij V,et al. Cardiac resynchronization sensitizes the sarcomere to calcium by reactivating GSK-3β[J]. J Clin Invest,2014,124(1):129-38.

[5] Thornton TM,Pedraza-Alva G,Deng B,et al. Phosphorylation by p38 MAPK as an alternative pathway for GSK3beta inactivation[J]. Science, 2008,320(5876):667-70.

[6] Matsuda T,Zhai P,Maejima Y,et al. Distinct roles of GSK-3alpha and GSK-3beta phosphorylation in the heart under pressure overload[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(52):20900-5.

[7] Antos CL,McKinsey TA,Frey N,et al. Activated glycogen synthase-3 beta suppresses cardiac hypertrophy in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(2):907-12.

[8] Gomez L,Paillard M,Thibault H,et al. Inhibition of GSK3beta by postconditioning is required to prevent opening of the mitochondrial permeability transition pore during reperfusion[J]. Circulation,2008, 117(21):2761-8.

[9] Nishino Y,Webb IG,Davidson SM,et al. Glycogen synthase kinase-3 inactivation is not required for ischemic preconditioning or postconditioning in the mouse[J]. Circ Res,2008,103(3):307-14.

[10] Haq S,Choukroun G,Kang ZB,et al. Glycogen synthase kinase-3beta is a negative regulator of cardiomyocyte hypertrophy[J]. J Cell Biol,2000,151(1):117-30.

[11] Zhou J,Lal H,Chen X,et al. GSK-3alpha directly regulates betaadrenergic signaling and the response of the heart to hemodynamic stress in mice[J]. J Clin Invest,2010,120(7):2280-91.

[12] Lal H,Zhou J,Ahmad F,et al. Glycogen synthase kinase-3α limits ischemic injury, cardiac rupture, post-myocardial infarction remodeling and death[J]. Circulation,2012,125(1):65-75.

[13] Zhou J,Freeman TA,Ahmad F,et al. GSK-3α is a central regulator of age-related pathologies in mice[J]. J Clin Invest,2013,123(4):1821-32.

[14] Lal H,Ahmad F,Zhou J,et al. Cardiac fibroblast glycogen synthase kinase-3β regulates ventricular remodeling and dysfunction in ischemic heart[J]. Circulation,2014,130(5):419-30.

[15] Kerkela R,Kockeritz L,Macaulay K,et al. Deletion of GSK-3beta in mice leads to hypertrophic cardiomyopathy secondary to cardiomyoblast hyperproliferation[J]. J Clin Invest, 2008,118(11):3609-18.

[16] Force T,Woodgett JR. Unique and overlapping functions of GSK-3 isoforms in cell differentiation and proliferation and cardiovascular development[J]. J Biol Chem,2009,284(15):9643-47.

[17] Zhai P,Gao S,Holle E,et al. Glycogen synthase kinase-3alpha reduces cardiac growth and pressure overloadinduced cardiac hypertrophy by inhibition of extracellular signal-regulated kinases[J]. J Biol Chem, 2007,282(45):33181-91.

[18] Ahmad F,Lal H,Zhou J,et al. Cardiomyocyte-specific deletion of Gsk3α mitigates post-myocardial infarction remodeling, contractile dysfunction, and heart failure[J]. J Am Coll Cardiol,2014,64(7):696-706.

[19] Porrello ER,Mahmoud AI,Simpson E,et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart[J]. Science,2011,331(6020): 1078-80.

[20] Leri A,Kajstura J,Anversa P. Mechanisms of myocardial regeneration[J]. Trends Cardiovasc Med,2011,21(2):52-8.

[21] Bergmann O,Bhardwaj RD,Bernard S,et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans[J]. Science,2009,324(5923):98-102.

[22] Kajstura J,Urbanek K,Rota M,et al. Cardiac stem cells and myocardial disease[J]. J Mol Cell Cardiol,2008,45(4):505-13.

[23] Laflamme MA,Murry CE. Regenerating the heart[J]. Nat Biotechnol, 2005,23(7):845-56.

[24] Chiong M,Wang ZV,Pedrozo Z,et al. Cardiomyocyte death: mechanisms and translational implications[J]. Cell Death Dis,2011,2(12):e244-76.

[25] Doble BW,Patel S,Wood GA,et al. Functional redundancy of GSK-3alpha and GSK-3beta in Wnt/beta-catenin signaling shown by using an allelic series of embryonic stem cell lines[J]. Dev Cell,2007,12(6):957-71

[26] Morisco C,Zebrowski D,Condorelli G,et al. The Akt-glycogen synthase kinase 3beta pathway regulates transcription of atrial natriuretic factor induced by beta-adrenergic receptor stimulation in cardiac myocytes[J]. J Biol Chem,2000,275(19):14466-75.

[27] Michael A,Haq S,Chen X,et al. Glycogen synthase kinase-3betaregulates growth, calcium homeostasis, and diastolic function in the heart[J]. J Biol Chem,2004,279(20):21383-93.

[28] Woulfe KC,Gao E,Lal H,et al. Glycogen synthase kinase-3beta regulates post-myocardial infarction remodeling and stressinduced cardiomyocyte proliferation in vivo[J]. Circ Res, 2010,106(10):1635-45.

[29] Wynn TA. Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases[J]. J Clin Invest,2007,117(3):524-9.

[30] Chen W,Frangogiannis NG. Fibroblasts in post-infarction inflammation and cardiac repair[J]. Biochim Biophys Acta,2013,1833 (4):945-53.

[31] Takeda N,Manabe I,Uchino Y,et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload[J]. J Clin Invest,2010,120(1):254-65.

[32] Duan J,Gherghe C,Liu D,et al. Wnt1/βcatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair[J]. EMBO J,2012,31(2):429-42.

[33] Bergmann C,Akhmetshina A,Dees C,et al. Inhibition of glycogen synthase kinase 3β induces dermal fibrosis by activation of the canonical Wnt pathway[J]. Ann Rheum Dis,2011,70(12):2191-8.

[34] Caraci F,Gili E,Calafiore M,et al. TGF-beta1 targets the GSK-3beta/beta-catenin pathway via ERK activation in the transition of human lung fibroblasts into myofibroblasts[J]. Pharmacol Res, 2008,57(4):274-82.

[35] Rao TP,Kühl M. An updated overview on Wnt signaling pathways: a prelude for more[J]. Circ Res,2010,106(12):1798-806.

[36] Schmierer B,Tournier AL,Bates PA,et al. Mathematical modeling identifies Smad nucleocytoplasmic shuttling as a dynamic signalinterpreting system[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(18):6608-13.

[37] Guo X,Ramirez A,Waddell DS,et al. Axin and GSK3-control Smad3 protein stability and modulate TGF- signaling[J]. Genes Dev,2008,22(1):106-20.

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（责任编辑：田国祥）

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