人乳腺癌干细胞异种移植动物模型研究进展

人乳腺癌干细胞异种移植动物模型研究进展

戴璟，谢茂云 综述，黄耀*审阅

(广东医学院福田医院 外科,广东 深圳518048)

乳腺癌作为一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤[1]。近45年来，乳腺癌的发病率在世界各国均呈上升趋势[2]。全世界每年新发乳腺癌约100万例，死亡约60万例[3]。乳腺癌的预防、诊断和治疗已经成为当今医学及生物科学研究的“热点”。干细胞或祖细胞已有研究证明在肿瘤发生、发展过程中成为恶性转化靶点的关键。肿瘤干细胞主要通过Notch,Wnt,Hedgehog等三条通路调解自我更新的信号传导[4-8]，如Notch途径的激活会导致细胞命运的改变；wnt信号转导途径的激活促进了上皮干细胞向上皮癌转化；Hedgehog信号通路在大多数乳腺癌中被激活，过度表达PTC1和GLI1(Hedgehog信号通路激活标记物)。上述通路的异常会导致正常乳腺的干细胞发生恶性转化，致使乳腺癌的产生。实验动物模型已今已成为是研究乳腺癌干细胞生物学行为的重要工具之一。

1实验动物的选择

异种移植模型：人类乳腺癌细胞株移植于免疫缺陷动物体内而建立的动物模型[9]。免疫缺陷动物本身具有肿瘤移植成功率高，需求细胞数目少；移植瘤的病理学、生物学特征更接近人体的原发瘤等特点。人乳腺癌异种移植主要选取的动物有重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠[10]。

1.1SCID小鼠模型鉴于SCID小鼠缺乏T和B淋巴细胞的特点，对体外移植物免疫排斥能力较低，为国内外学者在肿瘤生物学研究方面引起普遍重视。SCID小鼠建立的移植动物模型已广泛见于T和B细胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝细胞癌、结肠粘液腺癌和肺癌等。上述研究结果均显示SCID小鼠造模优于裸鼠[11-13]。叶丽虹等采用经胰酶消化的人乳腺癌MCF-7细胞悬液接种于SCID小鼠腋背皮下，每只接种0.2 ml，6-10天接种部位出现质硬肿瘤结节，成瘤率为5/5只，成瘤潜伏期为(7．4±1．3)d[14]。

1.2NOD/SCID小鼠非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交后获得NOD/SCID小鼠[15]。Beckhove等将MCF-7细胞株移植入NOD/Lt-SCID小鼠体内，不经射线照射，成瘤率大于 90%，经观察数天瘤体内显示有新生血管生成，各项肿瘤标志物的表达呈正相关性变化，建立了较好的模拟肿瘤的生长环境，提供检测新的抗癌治疗方式或药物的良好模型[16]。

1.3裸鼠胰酶消化后的MDA-MB-231和SK-BR-3细胞，用Hank液清洗2次，锥虫蓝染色，于雌性裸鼠左侧腋窝皮下接种0.2 ml/只。MDA-MB-231移植瘤5天潜伏期后，接种皮下可见灰白色结节，肿瘤接种成功率为90%。SK-BR-3移植瘤11 d潜伏期后，接种部位皮下可见灰白色结节，肿瘤接种成活率80%[17]。朱玮等将携带荧光素的酶(leu)基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231-lue于裸鼠下腹部乳腺脂肪垫内注射50 μl，裸鼠腹腔注射荧光素，进行光学成像检测。第7天时活体内可见明显发光，10天可见肿瘤病灶，肿瘤的平均体积在第2周到第5周时都呈上升趋势，对肿瘤体积和光子数进行回归分析，R2=0．901[18]。

2异种移植的制备方法

2.1人乳腺癌干细胞的发现与分离

2.1.1在对人乳腺癌干细胞的研究中的发现：乳腺癌干细胞在机体内存在自我更新及多向分化性潜能的细胞群体，可分化产生相应组织的成熟细胞，一个干细胞可通过对称和非对称分裂一个干细胞产生两个子细胞，一个与母细胞完全一致，具有母细胞同样的特征，故理论上可以发育成为完整的生物个体或组织器官[19]。肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSCs)作为一种特殊类型的干细胞，其本身已具有：增殖能力高、自身的更新能力及多向分化等功能[19]。肿瘤干细胞与干细胞在其各自的生长过程中存在相关的调控机制,其中Wnt、Hedgehog、Notch通路的某些信号调节及传导异常最终导致了肿瘤的发生[4-8]。AL-Hajj等首次发现了乳腺癌起源于癌干细胞的证据[21]，通过对人乳腺癌组织的分离，检出表面有CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-标志的细胞,将这些细胞移植入NOD/SCID小鼠体内,证实了能够产生明显肿瘤的细胞亚群的存在，提示乳腺癌中存在促进肿瘤发展的肿瘤干细胞。

2.1.2人乳腺癌干细胞的分离人乳腺癌干细胞分离方面具有较多的实验方法和实验方式，如通常采用的乳腺癌干细胞的分离方法：表面标志分选、流式细胞仪侧群分流、无血清悬浮培养等方法[22]。AL-Hajj等首次分离出表面标志为CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的实体肿瘤干细胞[21]。Liu[23]等利用表面标志CD44+、CD24-/low的细胞检测乳腺癌患者预后情况，发现这些细胞与患者的生存期和肿瘤复发相关联。在长时间的体外培育中，人乳腺癌干细胞在培育过程中其表面标志物发生改变。研究者又从人乳腺癌MCF-7细胞系分离出CD55high、CD55low细胞，其中CD55high细胞具有分化能力进一步加强趋势，展现CD55high细胞更具备肿瘤干细胞的生物性状[24]。侧群(side population,SP)分选利用干细胞带有特异性膜蛋白，如ABCG2(breast cancer resistance protein)，使其不能被DNA增补性染料Hoechst33342染色的特点进行干细胞分离。Patrawala[25]等在MCF7细胞株中分离出的SP亚群，SP亚群在致瘤性能力明显超过非SP细胞，另SP亚群即可可传代也可其他非SP细胞，充分显示其具有自我更新和多向分化能力及具有癌干细胞特性。也有相关研究者应用无血清悬浮培养体系进行乳腺癌原代细胞培养，无需明确的细胞标志，获取富集乳腺癌起始细胞的被称作“乳腺球(manlmo-sphere，MS)”的克隆性非黏附细胞集落[26]。起源于单个细胞的乳腺球能够分化成乳腺的多种不同的细胞系。郑文博等采用乳腺球悬浮培养法从人乳腺癌的肿瘤组织中成功分离并富集了原代肿瘤细胞，通过对其进行：CD44、CD24、ALDHl，ESA以及Oct4的检测，证实了其呈现肿瘤干细胞的表型[27]。由此可见，乳腺球悬浮培养法同样能够有效地分离并富集乳腺癌干细胞。

2.2造模方法

乳腺癌干细胞异种移植的动物模型分：为原代移植和细胞系移植两类[10]。AL-Hajj等通过对人乳腺癌组织分离，成功提取表面标志为CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的实体肿瘤干细胞[20],通过相应干细胞移植免疫缺陷小鼠的乳腺组织内经培养形成肿瘤,成瘤率近100%，培植肿瘤具有原发肿瘤的病理组织学特征。乳腺癌细胞系如MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3已广泛应用到乳腺癌异种移植的动物模型中[11,15,17]。乳腺癌干细胞异种移植常接种于小鼠的乳脂垫(mammary fat pad)与腋背侧皮下[28-29]。Price[30]等曾对比皮下接种和乳脂垫接种的差异，利用细胞株和MDA-MB-231、MDA-MB-435分别进行皮下注射接种和乳脂垫接种，发现乳脂垫接种后的成瘤率为100%，而皮下途径为40%。

3评价与展望

目前，乳腺癌干细胞异种移植的研究仍存在一定程度的不足。由于技术上的限制，需要通过表面标志分选、流式细胞仪侧群分流等方法对乳腺癌干细胞进行分离，未能找到对其富集、分离最佳方法。而异种移植模型仍存在缺乏人类乳腺癌组织中的间质细胞、缺少癌细胞周围的三维结构、缺少对肿瘤细胞的免疫反应等缺点。综上所述，乳腺癌干细胞是乳腺癌的起源,而乳腺癌干细胞动物模型的建立和研究，有助于更好地了解乳腺癌的生物学特性，选择相应的乳腺癌干细胞进行针对性乳腺癌靶向治疗,杀死肿瘤干细胞,将对乳腺癌预防、治疗、预后起不可忽视的作用。

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收稿日期：(2013-11-16)

文章编号：1007-4287(2015)03-0519-03

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