星点设计-效应面法优化牛心朴子叶多糖提取工艺的研究

■张 欣 贝盏临 杨海婵

(北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021)

牛心朴子(Cynanchum KomaroviiAl.Iljinski)俗称黑心脖子、老瓜头、芦心草，系萝摩科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum）多年生直立或半直立丛生草本植物。在我国主要集中分布在西北部的宁夏、内蒙等地的沙漠及河边或荒山坡，是喜光、极为耐旱、耐高温的强旱生适阳植物，是土地严重沙质荒漠化的指示植物之一，也是草原逆行演替过程中最后阶段的指示种。牛心朴子其生长条件要求不高，根系发达，耐寒，抗风沙，自我保护能力强，有很强的繁殖能力，在水分较少的干旱地带也能保持较高的吸水和持水能力，在半沙漠化地区显示了抗风固沙的优良特性，是干旱荒漠环境中的优势植种。近些年来随着中草药开发热潮的掀起，牛心朴子作为一种药用植物也开始为人们所知晓，因其茎叶有毒，不能作为一般药剂使用，所以在药用方面受到极大限制，但据很多地方文献记载，牛心朴子可用于镇痛，祛痰医药等方面，藏医用于治疗胆囊炎。现今对牛心朴子研究主要集中在从中分离出一些复杂化合物，如多结构烃类、多种分子结构复杂的生物碱、多糖等。很多种类成分对于医学及其它研究有重大意义，如牛心朴子中提取、精制的多糖对抗S180肉瘤效应初步观察实验中表明牛心朴子多糖有较好的抑瘤作用。这对于现今很多无法医治的肿瘤给予了可能的曙光，而如何能最大程度地提取、获得牛心朴子多糖工艺条件，这将对牛心朴子的资源高效利用尤为重要。

本试验以野生牛心朴子的叶为试材，以乙醇水溶液作为牛心朴子的叶多糖提取溶剂，依据星点设计-效应面法对因素变量（溶剂浓度、超声提取时间、料液比）进行二项式拟合，效应面法分析每个因素的显著性和交互作用来对牛心朴子叶中多糖的提取工艺进行优化，得到最佳的提取条件，为今后对牛心朴子叶多糖的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

牛心朴子成熟叶子，于2014年7月采自宁夏盐池县境内毛乌素沙漠边缘（东经107°24'2.09"，北纬37°53'7.21"），标本保存于北方民族大学生物科学系植物标本室。将新鲜牛心朴子叶子，放置于阴凉处阴干，然后用万能粉碎机进行粉碎，粉碎后过筛（80目）取细粉末，放入干净的密封塑料袋中保藏备用。

1.1.2 试验药品

无水乙醇，分析纯；蒽酮，分析纯；浓硫酸，AR；葡萄糖，标准品；活性炭。

1.1.3 试验器材

烘箱（DHG-9070A，380V/50HZ/140kw，武汉恒泰丰科试验设备有限公司）、微型植物粉碎机（FZ102，220V/180W，郑州博科仪器设备有限公司）、电子分析天平（FA3204B，220V/50HZ，上海天平仪器厂）、超声波清洗器（KQ-500B，500W/200v/40KHZ，昆山市超声仪器有限公司）、单光束紫外/可见分光光度计（UV1000，200V/50HZ/100W，沪制02270208号）、Millipore纯水/超纯水一体化系统（Di⁃rect-Q3,5,8）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

精确称取牛心朴子叶细粉末0.3 g，放入150 ml锥形瓶内，加入50%乙醇50 ml，超声提取30 min，活性炭（于25℃水浴中）脱色10 min、过滤，取滤液定容至1 000 ml。

蒽酮-硫酸试液：精密称取蒽酮0.2 g，加100 ml浓硫酸，溶解既得，现用现配使用。

1.2.2 多糖标准曲线的绘制

用UV765紫外-可见分光光度计在390～780 nm范围内进行波谱扫描，检测最大吸收峰波长为620 nm。以葡萄糖（标准品）测定的线性回归方程：y=0.038 4x+0.036 8，相关系数R2=0.999 3。

1.2.3 精密度试验

精密吸取对照品溶液0.5 ml，按照1.2.2方法，依次显色，测定吸光度，重复测定吸光度6次，计算吸光度相对标准偏差：RSD=1.8%，表明精密度良好。

1.2.4 多糖含量的测定

参考蒽酮-硫酸法，略有改动。

1.2.5 单因素分析

采用超声波、水提-醇沉法提取试验材料中多糖，并选取料液比、乙醇水溶液浓度、超声波浸提时间为影响试验的主要单因素，研究多糖得率。

1.2.5.1 乙醇水溶液浓度对牛心朴子叶多糖提取率的影响

室温（25±1）℃下采用水提-醇沉法提取牛心朴子叶中多糖，其中料液比为1∶15(g/ml）、超声波（功率为200 W）浸提时间为30 min，分别加入50 ml浓度为10%、25%、40%、55%、70%、85%的乙醇水溶液，进行提取。

1.2.5.2 超声波浸提时间对牛心朴子叶多糖提取率的影响

室温（25±1）℃下采用水提-醇沉法提取牛心朴子叶中多糖，其中加入50 ml浓度为50%乙醇水溶液、料液比为1∶15(g/ml）、超声波（功率为200 W）浸提时间分别为10、20、30、40、50、60 min，进行提取。

1.2.5.3 料液比对牛心朴子叶多糖提取率的影响

室温(25±1)℃下采用水提-醇沉法提取牛心朴子叶中多糖，其中加入50 ml浓度为50%乙醇水溶液、超声波(功率为200 W)浸提时间为30 min，料液比（g/ml）分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，进行提取。

1.2.6 效应面分析

综合单因素试验结果，采用效应面优化法（re⁃sponse surface methodology，RSM），实验设计采用星点设计(Central Composite Design,CCD)，选择出对多糖提取率有显著影响的k个因素进行试验，分别为：（A）乙醇水溶液浓度、（B）超声波浸提时间、（C）料液比，作为自变量，牛心朴子叶中多糖提取率作为因变量，按照CCD设计的方法进行多元线性回归和二项式拟合，用效应面法优化提取工艺条件。将每个因素设定5水平，分别用代码-α、-1、0、+1、+α表示，k表示因素个数，α表示极值，当k＜5时，α=(2k)1/4进行计算。效应面实验因素与水平见表1。

表1 试验因素水平

2 结果与分析

2.1 乙醇水溶液浓度、超声波浸提时间、料液比对牛心朴子叶多糖提取率的影响（见图1)

由图1所示，随着乙醇水溶液浓度增加，牛心朴子叶多糖提取率呈“S”型上升，从曲线中可以看出溶剂浓度在70%～85%的时候提取率达到了一个顶峰；随着超声提取时间的延长，牛心朴子叶多糖提取率也呈“S”型上升，从曲线中可以看出超声提取时间在设计的时间范围，50～60 min的时候牛心朴子叶提取率较高；料液比中随着液体的体积逐渐增大，牛心朴子叶多糖提取率呈先上升下降又上升的过程，从曲线中可以看出选择料液比在设计的比例范围，1∶20～1∶25的时候牛心朴子叶提取率较高。

2.2 星点设计试验计算

图1 溶剂浓度、超声提取时间、料液比对多糖提取率的影响

根据表1，效应面分析法中的星点设计CCD试验计算（A）乙醇水溶液浓度（v/v）、（B）超声提取时间（min）、（C）料液比（g/ml），其中λ为各因素中的极值，M为每个因素里的中值，k=3，α=1.682，此外根据[-1-(-α)]/（XA2-λA2）=[+α-(-α)]/（λA1-λA2）求解得XA2，（XA1+XA2）=（λA1+λA2）求解得XA1，其它 XB1、XB2、XC1、XC2同理求得。最终结果见表2。根据星点设计试验安排及结果见表3。将因变量（牛心朴子叶多糖提取率）与参考因素分别拟合为效应面与等高线（见图2～图4）。

2.3 提取条件的优化结果

通过软件Design-Expert8.0.6分析，各因素取最优值后的效应所能取到的最大值（见图5～图7），多糖取条件残差正态概率分布呈线性趋势拟合，残差与预测分布毫无规律，而预测与实际分布呈线性趋势拟合。当提取乙醇水溶液浓度（A）为80%，超声提取时间(B)为60 min，料液比(C)为1∶15 g/ml，牛心朴子叶多糖提取率最大值为2.89%(见表 3)。

表2 牛心朴子叶多糖提取条件的星点设计因素水平

表3 牛心朴子多糖提取条件的星点设计与效应面运算解决方案

图2 乙醇水溶液浓度与超声提取时间对多糖提取率影响的效应面与等高线

图3 乙醇水溶液浓度与料液比对多糖提取率影响的效应面与等高线

图4 超声提取时间与料液比对多糖提取率影响的效应面与等高线

图5 提取条件残差正态概率分布

图6 提取条件残差与预测分布

图7 提取条件预测与实际分布

3 结论

本实验考察了在室温条件下，以乙醇水溶液作为溶剂的不同浓度、超声波辅助提取的不同时间、料液比的不同比例，外界因素对牛心朴子叶多糖提取率的影响。随着溶剂浓度的增加，多糖提取率先上升后减缓又逐渐上升减缓的上升过程；随着超声提取时间的延长，多糖提取率先上升速度较快后上升减缓；料液比中随着溶剂体积逐渐增大，多糖提取率先上升下降又上升。星点设计-效应面法分析牛心朴子叶多糖的理论提取率最高值为2.89%，而依据此优化提取工艺模型进行牛心朴子叶多糖提取，实际提取率为2.78%，明显高于单因素条件的提取率，说明响应面分析的最优值真实可行，优化的提取条件具有实用价值。

（参考文献12篇，刊略，需者可函索）