多肽合成研究进展△

曲朋，宋利，赵好冬，胡学生，孙佳明，张辉

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

·综述·

多肽合成研究进展△

曲朋，宋利，赵好冬，胡学生，孙佳明，张辉*

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

多肽是一类生物活性很高的物质。本文从化学合成和生物合成两个方面综述了多肽的合成，介绍了固相合成、液相分段合成法、施陶丁格连接、天然化学连接、光敏感辅助基连接、可去除辅助基连接、化学区域选择连接、氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、组合化学法、酶解法、基因工程法、发酵法等合成方法的原理及其优缺点，对多肽合成方法的发展及其中药资源领域的应用进行了展望，为相关研究提供参考。

多肽；合成；进展

多肽是一类介于氨基酸和蛋白质之间的物质，由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。已发现存在于生物体内的多肽达数万种。多肽是一种蛋白质的结构片段，能起到蛋白质的活性基团作用，是人体新陈代谢、调节活动的重要物质。通过研究多肽的结构与功能之间的关系，进而了解多肽中各氨基酸系列的功能。在进行化合物的设计时，尽可能选择短肽，以便提高其生理活性，并且减少临床不良反应。在美国FDA1999年允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能之后，随着人们对多肽中各氨基酸系列功能了解的不断深入及多肽药物和保健品的持续高速发展、多肽合成技术的日益成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药领域，多肽药物的开发越来越受到人们的重视，其市场需求也在日益增加。本文对近年来多肽的合成方法与研究进展进行综述[1-5]。

1 多肽合成的分类

多肽的合成主要分为两条途径：化学合成和生物合成。

化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。在合成含有特定顺序的多肽时，由于合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体，合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了合成目标产物的定向性。多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。片段组合法主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根据多肽片段的化学特定性或化学选择性，多肽片段能够自发进行连接，得到目标多肽。因为多肽片段含有的氨基酸残基相对较少，所以纯度较高，且易于纯化。1963年，美国著名生物化学家Merrifield提出了固相合成法，开展了多肽固相合成，即将氨基酸的C末端(羧基端)连接在不溶树脂上，然后在此树脂上依次进行氨基酸的缩合、延长肽链。固相合成方法可分为叔丁氧羰基(Boc)方法和9-芴甲基氧羰基(Fmoc)方法。人们以多肽的液相和固相合成方法为基础又发展了氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、组合化学法等。

多肽的生物合成方法主要包括发酵法、酶解法，随着生物工程技术的发展，以DNA重组技术为主导的基因工程法也被应用于多肽的合成。

2 多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端(氨基端)进行合成。多肽固相合成的原理是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽[6]。

2.1 Boc合成法

Boc方法是经典的多肽固相合成法，以Boc作为氨基酸α-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc的脱除通常采用三氟乙酸(TFA)进行。合成时将已用Boc保护好的N-α-氨基酸共价交联到树脂上，TFA切除Boc保护基，N端用弱碱中和。肽链的延长通过二环己基碳二亚胺(DCC)活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，为了便于下一步的合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等[7]。

2.2 Fmoc合成法

Carpino和Han以Boc合成法为基础发展起来一种多肽固相合成的新方法—Fmoc合成法。Fmoc合成法以Fmoc作为氨基酸α-氨基的保护基。其优势为在酸性条件下是稳定的，不受TFA等试剂的影响，应用温和的碱处理可脱保护，所以侧链可用易于酸脱除的Boc保护基进行保护[8]。肽段的最后切除可采用TFA二氯甲烷(DCM)从树脂上定量完成，避免了采用强酸[9]。同时，与Boc法相比，Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc基团本身具有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行[10-11]。Fmoc法在多肽固相合成领域应用越来越广泛。

2.3 多肽固相合成法存在的问题

多肽固相合成法历经数十年的发展，经过不断改进和完善，虽然已经能够合成很多具有生物活性的多肽和蛋白质，但其本身还存在着很多问题与缺陷，如直接合成的序列短、所需时间长、合成的效率和纯度低、成本高等，这些问题都限制了多肽固相合成法的应用范围。

2.3.1 合成多肽的序列短 自从B Merrifield发明了多肽固相合成法后，多肽的化学合成成为蛋白质大量重组表达的有效辅助工具，被广泛应用于结构生物学、免疫学、蛋白质工程和生物药物研究中。尽管在肽链合成后的性质、分析等方面都有很大提高，但是当肽链残基大于30个，尤其超过50个时，肽链的合成就会受到一定程度的制约。这是由于在多肽固相合成时，聚合物的局限在于激活羧基时，合成肽的浓度较低，即使使用叠氮法可以有效防止外消旋的发生，但反应仍相对缓慢[12]。因此，多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成(30个氨基酸以内，少数为50个氨基酸以内)。大片段多肽的合成，可以应用基因工程法、液相合成法等。

2.3.2 合成时间长 经过四十多年的发展，多肽固相合成的速率取得了很大提高，但是相对其他合成方式(如生物合成法)来说，肽链的合成速率仍然很慢。每结合上一个氨基酸大约需要20～120 min[13]，平均一个九肽的合成需要5 h以上[14]。另外，当合成结构较复杂的多肽序列时，链的结合时间更长。

2.3.3 合成效率及纯度低，成本高 对于富含二硫键和碱性氨基酸残基的多肽固相合成，即使是在30个氨基酸以内，仍比较困难，一部分多肽不能成功合成。随着氨基酸数量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增长，目的肽的纯度相应降低，后续的纯化和重复性愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵，多肽合成的成本高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。

2.3.4 合成试剂的毒性大 DCM、DMF为多肽固相合成的首选试剂，其应用量大，毒性高，对身体及周边环境危害大。这些有机化学试剂成为废液后均需要报环保局进行处理。在合成过程中应用的仪器大多可在全封闭条件下进行，但其排出的废气、废液等，对环境仍有一定的污染，不能保证百分百安全。而那些不是全封闭进行的合成反应，有毒试剂对环境的危害更大。因此，随着多肽固相合成法的发展与广泛应用，研制开发出新型的、危害小的合成试剂的需求越来越迫切。

3 多肽液相分段合成

随着多肽合成的发展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依据其化学专一性或化学选择性，自发连接成长肽的合成方法)在多肽合成领域中的作用越来越突出。其特点在于可以用于长肽的合成，并且纯度高，易于纯化。多肽液相分段合成主要分为天然化学连接和施陶丁格连接。天然化学连接是多肽分段合成的基础方法，局限在于所合成的多肽必须含半光氨酸(Cys)残基，因而限定了天然化学连接方法的应用范围。天然化学连接方法的延伸包括化学区域选择连接、可除去辅助基连接、光敏感辅助基连接。施陶丁格连接方法是另一种基础的片段连接方法，其为多肽片段连接途径开拓了更广阔的思路。正交化学连接方法是施陶丁格连接方法的延伸，通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率[15-16]。

3.1 天然化学连接

天然化学连接方法能够简单有效地实施多肽片段的连接。Kent等[17-18]将C端为硫酯的多肽片段与N端为Cys残基的多肽片段在磷酸盐缓冲液中进行反应，从而得到以Cys为连接位点的多肽。反应步骤如下：C端的硫酯与N端Cys残基的侧链巯基进行酯交换反应，生成新的硫酯中间体，此中间体自发形成过渡态五元环，继而又迅速进行酰基迁移，最后形成了以Cys为连接位点的多肽产物。

Tam等[19]利用天然化学连接技术制备了含多个Cys残基的环状蛋白；Shin等[21]成功地合成出具有抗菌活性的糖蛋白；Duhee等[22]通过两段缩合和三段缩合的途径合成了一种含46个氨基酸残基，分子结构稳定的蛋白质Crambin;Regula等利用该方法合成了含69个氨基酸残基的前神经多肽-proNPY；Gapbor等[23]也利用该方法成功合成了第一个半合成的丝氨酸蛋白酶-SGT。

3.2 化学区域选择连接

化学区域选择连接方法，是拟Cys位点的连接技术，即以2-巯苄基(2-mercaptobenzyl)作为辅助基与硫酯发生亲核反应。通过给电子基团的引入，可增加芳环上的亲核性和电子浓度，从而提高限速步骤、硫酯交换反应的速率及辅助基对酸的敏感度，这大大加快了片段间的缩合速度，同时也有利于辅助基的脱除。

Liang等[24]利用化学区域连接技术，以丙氨酸(Ala)-甘氨酸(Gly)为位连接位点，合成出了环状抗生素小菌素J25；John等[25]以赖氨酸(Lys)-Gly为位连接位点，成功合成了含有62个氨基酸残基的Scr同源域-3(SH-3)；Francesco等[26]也利用该方法合成了新甘油共轭体和对寡聚糖的模拟。

3.3 可去除辅助基连接

化学区域选择连接方法缩合的多肽片段是无侧链保护片段，在合成时，须用强酸，如HF脱去侧链保护基和树脂。但产物肽段对酸不稳定，易受到强酸的影响。在辅助基选择的研究中发现，苯胺衍生物Nα-(1-苯基-2-巯乙基)辅助基团不仅具有对强酸保持稳定，还具有提高片段间缩合速率的优点，使得N端多肽片段较易合成，由此衍生出新的连接方法—可去除辅助基连接。Paolo等[27]利用可除去辅助基连接方法合成出了TATA结合蛋白-TBP-A、巨噬细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)、Mouse Larc等；另外，Raffaele等[28]在该方法的研究过程中还发现，在一定条件下Cu+和Cu2+可促进缩合反应的进行。

3.4 光敏感辅助基连接

在辅助基的研究中发现O-硝基苄基(O-nitrobenzyl)不稳定，尤其在光照条件下，为了得到更柔和的、易于除去且稳定的辅助基，将O-硝基苄基(O-nitrobenzyl)与巯乙基相连接，得到新的辅助基-NA-2-巯基-1-(2-硝基苯)乙基，也称Mnpe辅助基。该辅助基具有很强的亲核性，不仅有很高的缩合率，而且在光照条件下易分解，辅助基易于脱除。Torus等[29]使用该方法合成了具有20个氨基酸残基的多肽，证实了Mnpe辅助基作为合成多肽辅助基的可行性，并且大大提高了产物的纯度。

3.5 施陶丁格连接

Staudinger等[30]以叠氮反应为基础，发展了施陶丁格连接方法，该方法与天然化学连接方法一样，都是多肽片段缩合的基础。施陶丁格连接是以C端的膦硫酯与N端的叠氮化合物反应，生成具有亲核性氮的中间体—亚氨正膦，亚氨正膦分子自身发生分子内重排，得到酰胺膦盐，酰胺膦盐再水解得到目的多肽和膦氧化物[31]。

正交化学连接是施陶丁格连接方法的改进，是通过将过渡态结构缩小，减小亲核性的酰亚氨中的氮与亲电子性的硫酯中碳的距离，提高产物的产率。在正交化学连接研究中发现，亚甲基取代辅助基中的苯基，降低了膦的亲核性，使其对氧气的敏感度降低，减小了氧化反应的可能性。因此，同样在Gly位点进行缩合，其缩合率高达92%。另外，利用正交化学连接法成功地合成出含124个氨基酸残基的核糖核酸酶A(RNase A)[32-33]。

4 其他多肽合成方法

4.1 氨基酸的羧内酸酐法(NCA)

氨基酸的羧内酸酐的氨基保护基也可活化羧基。NCA的原理：在碱性条件下，氨基酸阴离子与NCA形成一个更稳定的氨基甲酸酯类离子，在酸化时该离子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又与其他的NCA结合，反复进行。NCA适用于短链肽片段的合成，其周期短、操作简单、成本低、得到产物分子量高，在目前多肽合成中所占比例较大，技术也较为通用[34]。

4.2 组合化学法

20世纪80年代，以固相多肽合成为基础提出了组合化学法，即氨基酸的构建单元通过组合的方式进行连接，合成出含有大量化合物的化学库，并从中筛选出具有某种理化性质或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案。组合化学法的合成策略主要包括：混合-均分法、迭代法、光控定位组合库法、茶叶袋法等。组合化学法的最大优点在于可同时合成多种化合物，并且能最大限度地筛选各种新化合物及其异构体。Dubs等[35]利用化学选择平行方法，得到了含有102种两亲性黑色素细胞刺激素(R-MSH)的类似物的肽库。经药理测试发现，其中84种化合物的AMPs的诱导性高于R-MSH促效剂Melitane。提高合成化合物组合库的分子多样性及开发与之配套的快速分析和鉴定手段是目前迫切需要解决的问题。

4.3 酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白质和动物蛋白质，获得小分子多肽。酶解法因其多肽产量低、投资大、周期长、污染严重，未能实现工业化生产。邹远东教授等[36]利用酶解法开发出大豆多肽、大豆寡肽、鲍鱼肽、海参肽、苦瓜肽、鱼翅肽、燕窝肽等一系列多肽产品。酶解法获得的多肽能够保留蛋白质原有的营养价值，并且可以获得比原蛋白质更多的功能，更加绿色，更加健康。

4.4 基因工程法

基因工程法主要以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。有研究者通过基因工程法获得了准弹性蛋白-聚缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。利用基因工程技术生产的活性多肽还有肽类抗生素、干扰素类、白介素类、生长因子类、肿瘤坏死因子、人生长激素，血液中凝血因子、促红细胞生成素，组织非蛋白纤溶酶原等。基因工程法合成多肽具有表达定向性强，安全卫生，原料来源广泛和成本低等优点，但因存在高效表达，不易分离，产率低的问题，难以实现规模化生产。

4.5 发酵法

发酵法是从微生物代谢产物中获得多肽的方法。虽然发酵法的成本低，但其应用范围较窄，因为现在微生物能够独立合成的聚氨基酸只有ε-聚赖氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和蓝细菌肽。

5 结束语

随着市场尤其医疗卫生方面对多肽产品需求的日益增加，多肽合成产业在迅速地发展，更多的多肽合成企业在建立。此外，中药资源的日益减少，使许多以多肽类为主要成分的中药应用受到限制，不能满足各个领域的需求。多肽合成技术的出现和不断完善很好地解决了这个问题。对于已知完整结构的多肽，应用多肽合成技术进行合成，既保护了中药资源又满足了市场需求。多肽产业的高速发展同样带动了合成技术的发展，需要更加方便、有效、成本低、毒害小、产率高、易于实现规模化生产的合成技术以及分离纯化技术。作为21世纪重点研究领域，多肽产业的发展也面临着研发力量薄弱、仿制、技术水平低等问题，应通过加大研发投入，完善原有技术，挖掘新技术等途径，保证多肽产业高效、安全地发展。

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ResearchProgressofPeptideSynthesis

QUPeng,SONGLi,ZHAOHaodong,HUXuesheng,SUNJiaming,ZHANGHui*

(ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,130117 ,China)

Peptide is a kind of important biological active substance. This article summarized from two aspects of chemical synthesis and biosynthesis of synthetic polypeptides. The principle advantages and disadvantages of solid-phase synthesis, liquid segment synthesis, Staudinger ligation, native chemical ligation，enzymatic method, genetic engineering and fermentation were introduced. The development of peptide synthesis methods and applications in the field of traditional Chinese medicine resources were prospected.

peptide；synthesis；progress

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.023

2014-10-27)

国家自然基金项目—肽链热振荡理论对动物类中药材炮制机理的研究(81073048)

*

张辉，教授，博士生导师，研究方向：药用动物基础与应用开发研究；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com