肌联蛋白基因截断突变致家族性扩张型心肌病的研究进展

李发有综述，范洁审校

扩张型心肌病（DCM） 是一种原因不明的以心腔左心室和（或）双心室扩大、心肌收缩功能减弱为主要特征的异质性心肌病。临床表现为进行性加重的心力衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死。常根据病因是否明确将DCM分为特发性（原发性）DCM和继发性（获得性）DCM。

特发性DCM原因不明，行心血管疾病筛查，家族性扩张型心肌病（FDCM）比例高达48%[1]。扩张型心肌病患者中，约有25%为基因突变遗传因素所致[2]，提示遗传缺陷在FDCM的发病过程中具有重要作用。到目前为止，已经发现31个常染色体和2个X染色体突变基因与FDCM有关，现就FDCM的诊断标准、遗传特点及肌联蛋白基因截断突变的研究进展情况进行综述如下。

1 扩张型心肌病的定义及家族性扩张型心肌病的诊断标准

扩张型心肌病的定义[3]：左心室短缩分数（FS）＜25%和（或）左心室射血分数（LVEF）＜45%，且左心室舒张末期内径（LVEDD）＞117%按年龄和体表面积校正的预计值，排除任何病因明确的心脏疾病。

家族性扩张型心肌病的诊断标准[3]：患者家族中有两个或以上家族成员符合扩张型心肌病的诊断标准；或是扩张型心肌病患者一级亲属在35岁前有不明原因的猝死家族史。

2 家族性扩张型心肌病的遗传学特征

遗传方式的多样性[4]：包括常染色体显性遗传及隐性遗传、X连锁遗传和线粒体遗传。常染色体显性遗传即患者的双亲之一往往是患者，家族成员中常有多例患者，可达半数以上，男女患病机会均等，其特点是有近50%的外显率；常染色体隐性遗传，即患者的双亲都不是患者，但均是致病基因的携带者；X-连锁遗传，其特点是女性携带FDCM相关基因，但不发病，患者均为男性。

遗传基因外显率不全[5]：即携带致病突变的个体不表现出FDCM的任何表型，因此，在携带可疑致病突变而缺失FDCM表型的部分个体，尚不能认为突变与FDCM无关，对任何年龄临床心血管评估阴性的高危家族成员，不能排除FDCM晚发的可能性。需要周期性重复对高危家族成员筛查和评估。FDCM还显示出年龄相关性的外显率，致病突变个体通常要到40～60岁或更晚才表现出疾病表型。另一个FDCM的特征是多变的表现型，即部分患者仅表现出部分表型特征。很多FDCM的家属仅有超声心动图的异常或传导系统异常，而无明显的临床症状，存在无症状的致病基因的携带者。目前已知的DCM致病基因包括编码肌节蛋白、Z线、细胞骨架、线粒体、RNA结合蛋白、肌浆网及核膜[5]。而肌节蛋白和细胞骨架蛋白是DCM致病基因最常见的突变靶点。

3 肌联蛋白基因截断突变致家族性扩张型心肌病的病理生理机制

许多心肌病都有遗传因素参与，它们大多数发生在编码肌节蛋白和细胞骨架蛋白的基因上。TTN编码巨蛋白肌联蛋白，肌联蛋白是肌小节的重要组成单元，也是人体最大的蛋白和第三大含量最多的横纹肌蛋白，由大约33000个氨基酸组成。两分子肌联蛋白共同横跨肌节并锚定在肌节Z线和M线上[6,7]。人类肌联蛋白的分子结构由四个不同的部分组成，它们分别是位于氨基端的Z线、I带和A带区以及位于羧基端的M线，M线的末端由最后6个外显子（358-363）或Mex1至Mex6编码，肌联蛋白扮演着装配肌节的重要角色[8]，感受机械刺激并转换成生物化学信号，在横纹肌中提供被动张力，调节肌节的主动收缩力[9]。与其他已知的DCM致病基因相比，关于TTN突变效应的研究相对较晚。TTN的分子大小是肌球蛋白的12～16倍，TTN包含283kb碱基对、363个外显子，编码38138个氨基酸[1,10]。这足以表明它是常见的突变靶点。有两方面的原因可以解释为什么有较少的TTN突变被发现。首先巨大的TTN分子使传统的分子生物学方法难以运用于检测突变。其次，存在大量的多种TTN蛋白亚型，TTN经过选择性剪切后产生多种骨骼肌和心肌亚型[7]，并且受RNA结合基序蛋白（RBM）基因的调控，该基因与大约2%的DCM有关[11,12]。心脏相关的亚型包括N2B、N2BA和 NOVEX-3[6]。进一步的研究表明有多种亚剪切途径能产生N2BA亚型，剪切途径的异质性在肌节的PEVK区更为复杂[10]。更新的扩张型心肌病指南提到在Bcl-2相关抗凋亡基因3（BAG3）上的突变，包括大段缺失突变占DCM的2%，而TTN截断突变占DCM的25%[1]。TTN截断突变在DCM患者中高达27%，而单基因引起的DCM仅占6%～8%[6]。TTN相关的DCM在先前的研究中已有报道[12,13]。

Gramlich等[14]首次报道敲入TTN突变小鼠的特性，这跟先前报道的人体TTN突变相似[15]，这种常染色体上的显性遗传产生一个终止密码子和一个截断表达蛋白，杂合子个体最终发展为扩张型心肌病致猝死，但外显率不全。用TTN蛋白抗体的蛋白免疫印迹技术证实在敲入TTN突变的杂合个体有截短的肌联蛋白表达，这种截短的肌联蛋白量比预想中的要少，可能与升高的蛋白水解作用有关[10]。Roncarati等[16]用全外显子测序来探究家族性DCM异质性的原因，该研究发现双杂合子突变核纤层蛋白A/C基因（Lamin A/C，LMNA）:p.K219T/TTN:p.L4855F患者心脏移植的年龄远远小于单杂合子的LMNA:p.K219T患者。与单杂合子突变相比，观察到双杂合子突变患者的心肌细胞核增长，肌节排列紊乱，心肌细胞核聚集现象。在LMNA:c.656A＞C+TTN:c.14563C＞T患者可以观察到显著的心肌纤维化。该研究认为TTN:c.14563C＞T在携带LMNA突变的状态下作为一个修饰因子恶化DCM的临床表现。c.14563C＞T把脂肪族氨基酸亮氨酸替换成芳香族氨基酸苯丙氨酸，突变致病性预测工具Taster预测c.14563C＞T是一个致病性替换，基于文献数据，亮氨酸替换苯丙氨酸能导致受影响蛋白的功能缺失。

最近的一个研究表明，两个碱基对插入的TTN杂合子小鼠是能存活的并且显示正常的心脏形态。另一方面，当杂合子小鼠长期给以血管紧张素Ⅱ或异丙肾上腺素，小鼠的左心室显著扩大[14]。因此，在应急情况下，小鼠肌联蛋白的功能缺陷被显现出来。核纤层蛋白A结合到肌联蛋白的羧基端能导致肌节的机械-化学力量的转换[17]，从而推断LMNA和TTN的复合突变以协同作用的方式恶化肌节的机械-化学力量转换。

近年来，第二代测序技术（NGS）已经发现了许多新的TTN突变，并逐渐认识到TTN是人类遗传性疾病的一个重要突变基因[18]，事实上几乎所有新报道的TTN突变都是杂合子，这些突变在成人发病的心肌或骨骼肌中呈现出显性表型。特别是杂合子TTN截断突变已经被报道是DCM最常见的遗传因素，然而，截断TTN突变也被报道在3%的正常健康人群，这足以说明解释TTN突变的病理机制是困难的[6]。此外，几个与疾病相关的肌联蛋白结构域作用仍有待确定，这包括肌联蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶结构域（TK），TK结构域在控制肌肉组织的基因表达和蛋白质转换中起重要作用。敲出纯合子小鼠TK编码区和邻近的TTN外显子（Mex1和Mex2）可导致孕中期的胚胎死亡[8]。McNally等[19]认为一些TTN突变破坏肌联蛋白的激酶结构域，可能损害传递细胞信号的蛋白导致异常的肌节延长，当肌节拉伸过长时，对信号的感知、传达障碍使得心肌细胞更易受到来自肌肉活动的损害，另外一些突变可能会破坏肌节在肌肉收缩时的弹性回缩。Herman和同事观察到少数对照组携带肌联蛋白功能异常的基因突变，这一现象表明可能有其他遗传或环境因素增强了这些突变的致病能力，而那些无症状的个体可能携带有其他突变基因，这些突变基因主动抑制了TTN突变的效应。

Chauveau等[8]认为杂合子双亲的表型缺陷证明不是所有的截断TTN突变，尤其是在M线上的突变，都有临床表型，除非伴有第二种突变。在他们的研究中，基因型和表型的分析表明心脏的表型严重性与TTN突变的位置有关，父母有TK区的突变会表现出危及生命的心脏表型，而那些羧基端的突变很少会有严重的表型，甚至无任何心肌受累。截短肌联蛋白的错折叠、蛋白间相互作用的紊乱及肌节结构的不完整性和弹性回缩力异常都可能导致疾病表型的表达。

Herman等[6]的研究纳入了312例DCM患者，231例肥厚型心肌病，249例对照，并用第二代测序技术分析所有研究对象TTN基因。该研究发现多种TTN突变，包括错义突变、无义突变、框移突变、剪切突变、重复数突变。这些突变预测可能改变肌联蛋白的氨基酸序列，并将它们归类为TTN截断突变。因为TTN无义突变、框移突变、剪切突变及重复数突变被预测实质性改变肌联蛋白结构，这些突变在DCM组比肥厚型心肌病组和对照组频率更高，且发现突变与DCM共显现遗传，推断这些突变可能导致DCM。研究者发现DCM中TTN截断突变是随机分布在肌联蛋白上，它们主要集中在肌节的A带区域而不存在于Z带和M带区。肥厚型心肌病组和对照组中突变的空间分布与DCM组不同，在肥厚型心肌病组和对照组中发现的突变很少集中在肌联蛋白的A带区域（40% vs 84%）与DCM组突变相对。TTN截断突变的DCM患者通常不伴有传动系统或骨骼肌系统疾病。来源于TTN截断突变的人体心肌组织病理特征改变类似于特发性DCM。TTN突变（包括无义突变和框移突变）预测能引起蛋白截短，剪切供体或受体位点突变引起外显子跳跃或外显子序列缺失和大段的串联插入，推断这些等位基因突变产生生物学特性异常的截短肌联蛋白，最终导致DCM的发生。在DCM组中，用第二代测序技术检出的TTN截断突变比用双脱氧法的检测率高，差异有统计学意义（P＜0.01）。DCM家系研究显示TTN截断突变外显率在40岁以上的患者中超过95%。TTN截断突变可能通过以下几个机制改变完整的肌联蛋白结构导致DCM。RNA和蛋白监视途径最可能降解一些截短的肌联蛋白肽，低水平的肌联蛋白可能限制肌节的形成和引起心功能不全、心室重构。免疫组化分析显示一些截短肌联蛋白的羧基端整合在肌节上，引起隐性的早发的的骨骼肌和心肌病。另外，如果邻近的TTN截断突变由于单倍剂量不足引起DCM，那么这种突变的分布更集中于肌联蛋白的易变区。相比之下，该研究观察到DCM的一个不均一突变分布，这与没有DCM的患者不一致。这种不规则的突变分布表明DCM截短的肌联蛋白被整合到肌节上，是以一种负显性的机制引起DCM。

Gerul等[20]在研究澳大利亚DCM大家系中报道了一种新的TTN杂合突变，该突变缺失一个碱基对（c.62890delG）表现出与疾病共分离现象，这种TTN基因上碱基对（c.62890delG）的缺失引起基因的移码突变，由于提前出现终止密码子产生了截短的A带肌联蛋白，而在300例的对照组中未发现这种突变。家族性DCM表现出不完全的疾病外显率和多变的表型表达，常常使得临床诊断困难。在家系研究中观察到一个大的表型变化范围，发病年龄从20～80岁不等。关于家族性DCM不完全的疾病外显率原因目前还不清楚，可能与性别、遗传或表观遗传修饰或其他因素有关。

近年来，不断改进的遗传病诊断技术提高了对DCM复杂的遗传学认识，增加了我们对致病突变和原来不明意义的突变识别，第二代测序技术显著减少了测序成本，使得基因检测，尤其像TTN这样分子量大的基因检测成为可能，随着突变基因集合的增多，第二代测序技术诊断FDCM的敏感性高达27%～37%，使其应用于临床筛查无症状FDCM拥有较好的前景[21]。

4 展望

遗传因素在FDCM发生发展过程中起着重要作用，从基因水平寻找FDCM病因及发病机制具有重要的意义，突变基因的检测为FDCM的诊断与防治开辟了新的途径，这将有利于对FDCM的早期诊断、早期预防及特定基因的个体化治疗。近年来随着第二代测序技术应用于基因突变检测，TTN截断突变致 FDCM的分子遗传学机制受到越来越多的关注。然而FDCM的发病是环境和遗传因素相互作用的结果，其表型和外显率的异质性启示我们可能有其他修饰基因参与FDCM的发病，目前FDCM分子遗传学机制还不十分清楚，从基因水平或蛋白质组学水平研究FDCM的分子遗传学机制仍是今后研究的一个主要方向。

[1]Morales A, Hershberger RE.Genetic evaluation of dilated cardiomyopathy. Curr Cardiol Rep, 2013, 15: 1-8.

[2]陈在嘉. 心血管病与基因突变 (1)家族性肥厚型心肌病和扩张型心肌病与基因突变 . 中国循环杂志 , 1999, 3: 4-5.

[3]Mestroni L, Maisch B, McKenna WJ, et al. Guidelines for the study of familial dilated cardiomyopathies. Collaborative Research Group of the European Human and Capital Mobility Project on Familial Dilated Cardiomyopathy. Eur Heart J, 1999, 20: 93-102.

[4]Fatkin D. Guidelines for the diagnosis and management of familial dilated cardiomyopathy. Heart Lung Circ, 2011, 20: 691-693.

[5]Hershberger RE, Siegfried JD. Update 2011: clinical and genetic issues in familial dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol, 2011, 57:1641-1649.

[6]Herman DS, Lam L, Taylor MR, et al.Truncations of titin causing dilated cardiomyopathy. N Engl J Med, 2012, 366: 619-628.

[7]Guo W, Bharmal SJ, Esbona K, et al. Titin diversity-alternative splicing gone wild. J Biomed Biotechnol, 2010, 2010: 753675.

[8]Chauveau C, Bonnemann CG, Julien C, et al. Recessive TTN truncating mutations define novel forms of core myopathy with heart disease. Hum Mol Genet, 2014, 23: 980-991.

[9]Voelkel T, Linke WA. Conformation-regulated mechanosensory control via titin domains in cardiac muscle. Pflugers Arch, 2011, 462:143-154.

[10]Greaser ML. Stressing the giant: a new approach to understanding dilated cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol, 2009, 47: 347-349.

[11]Brauch KM, Karst ML, Herron KJ, et al. Mutations in ribonucleic acid binding protein gene cause familial dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol, 2009, 54: 930-941.

[12]Guo W, Schafer S, Greaser ML, et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nat Med, 2012, 18: 766-773.

[13]Yoskovitz G, Peled Y, Gramlich M, et al. A novel titin mutation in adult-onset familial dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol, 2012, 109:1644-1650.

[14]Gramlich M, Michely B, Krohne C, et al. Stress-induced dilated cardiomyopathy in a knock-in mouse model mimicking human titinbased disease. J Mol Cell Cardiol, 2009, 47: 352-358.

[15]Gerull B, Gramlich M, Atherton J, et al. Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cardiomyopathy.Nat Gen, 2002, 30: 201-204.

[16]Roncarati R, Viviani Anselmi CV, Krawitz P, et al. Doubly heterozygous LMNA and TTN mutations revealed by exome sequencing in a severe form of dilated cardiomyopathy. Eur J Hum Genet, 2013,21: 1105-1111.

[17]Simon DN, Wilson KL. The nucleoskeleton as a genome-associated dynamic 'network of networks. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12: 695-708.

[18]Ceyhan-Birsoy O, Agrawal PB, Hidalgo C, et al. Recessive truncating titin gene, TTN, mutations presenting as centronuclear myopathy.Neurology, 2013, 81: 1205-1214.

[19]McNally EM. Genetics: broken giant linked to heart failure. Nature,2012, 483: 281-282.

[20]Gerull B, Atherton J, Geupel A, et al. Identification of a novel frameshift mutation in the giant muscle filament titin in a large Australian family with dilated cardiomyopathy. J Mol Med (Berl), 2006,84: 478-483.

[21]Pugh TJ, Kelly MA, Gowrisankar S, et al. The landscape of genetic variation in dilated cardiomyopathy as surveyed by clinical DNA sequencing. Genet Med, 2014, 16: 601-608